Univerzita Karlova v Praze Matematicko-fyzikální fakulta Fyzikální ústav UK DISERTAČNÍ PRÁCE. Mgr. Josef Kapitán

Transkript

1 Unverzta Karlova v Praze Matematcko-fyzkální fakulta Fyzkální ústav UK DISERTAČNÍ PRÁCE Mgr. Josef Kaptán Teoretcký a expermentální rozvoj Ramanovy optcké aktvty jako metody studa bomolekul ve vodném prostředí Theoretcal and Expermental Development of Raman Optcal Actvty as a Stereochemcal Probe for Aqueous Envronment Školtel: Doc. RNDr. Vladmír Baumruk, DrSc. Konzultant: RNDr. Petr Bouř, CSc., Ústav organcké cheme a bocheme AV ČR Studjní program: Fyzka, obor: Bofyzka, chemcká a makromolekulární fyzka Praha 6

2 Poděkování Především bych chtěl poděkovat Vladmíru Baumrukov a Petrov Bouřov za velm podnětné vedení. Bez jejch cenných rad a podpory by nebylo možné tuto prácí vytvořt. Bylo velkým potěšením s nm pracovat. Vladmíru Baumrukov bych chtěl poděkovat zvláště za to, že mě uvedl do světa Ramanovy optcké aktvty a také že jako jedný nkdy nepochyboval, že se podaří náročnou přestavbu spektrometru dokončt. Petru Bouřovov děkuj, za seznámení se světem kvantově-chemckých smulací. Bylo radostí být přítomen vytváření jeho modelů popsujících reálné bomolekulární systémy. Také většna programů používaných na smulac spekter je jeho dílem. Dále bych rád poděkoval Petru Maloňov, Jaroslavu Šebestíkov, Petru Nederhafnerov a Haně Hulačové za syntézu a poskytnutí vzorků hnge peptdu a jeho analogů. Můj velký dík také patří mstru Mloš Rchterov za výrobu celé řady mechanckých držáků, teplotní cely a dalších komponent nutných pro přebudování aparatury. Bez jeho velké dovednost a nevyčerpatelných zkušeností by přestavba byla mnohem složtější. Děkuj také Jřímu Bokov za podporu př psaní ovládacího programu ROA spektrometru a za napsání knhovny pro kalbrac spekter. Také velm děkuj Petru Prausov za konzultace a veškerou pomoc př opravách elektronckých částí aparatury. Kolektvu Oddělení fyzky bomolekul Fyzkálního ústavu UK děkuj za vytvoření velm přátelského, tvůrčího a nsprujícího prostředí pro prác. Grantové agentuře UK děkuj za podporu poskytnutou v roce 5. V neposlední řadě bych chtěl velm poděkovat snoubence Pavle a své rodně za všelkou podporu, bez níž by tato práce také nemohla vznknout.

3 Obsah Seznam použtých zkratek... 4 Úvod Cíle práce Ramanova optcká aktvta - přehled současného stavu.... Expermentální přístupy k měření ROA.... Molekulární systémy studované pomocí ROA Smulace spekter Teore Ramanovy optcké aktvty Born-Oppenhemerova aproxmace a separace stupňů volnost Harmoncká aproxmace a zavedení normálních vbračních módů Teore Ramanovy optcké aktvty Ab nto metody výpočtu ROA ntenzt Teore elektronové hustoty (DFT) Modely rozpouštědla Optmalzace geometre Přenos tenzorů molekulárních vlastností Použtí molekulární dynamky př studu reálných systémů Expermentální uspořádání, metodka měření a zpracování ROA spekter Pops ROA spektrometru ROA experment Sestavování aparatury Programové vybavení ROA spektrometru Měření ROA spekter Kalbrace spekter Příprava vzorků (obecné zásady) Zpracování spekter Fourerova transformace a její využtí př zpracování dat Standardzovaný postup zpracování spekter Výsledky a dskuze Vlv konformační flexblty na rozšíření pásů v Ramanových a ROA spektrech alannu Příloha : J. Kaptán et al., J. Phys. Chem. A (v recenzním řízení) 5. Studum dynamky prolnového kruhu a nterakce s rozpouštědlem Příloha : J. Kaptán et al., rukops článku pro J. Phys. Chem. A (přpraveno k odeslání) 5.3 Studum konformace prolnového kruhu v poly(l-prolnu)... 9 Příloha 3: J. Kaptán et al., J. Am. Chem. Soc. 6 (přjato k publkac) 5.4 Ramanova optcká aktvta hnge peptdu a jeho analogů Příloha 4: J. Kaptán et al., Collect. Czech. Chem. Commun. 7 (5) Příloha 5: J. Kaptán et al., Vbratonal Spectroscopy 6 (přjato k publkac) Závěr Lteratura

4 Seznam použtých zkratek D dvojrozměrné CCD charge coupled devce CD crkulární dchrosmus DCP duální kruhová polarzace (dual crcular polarzaton) DFT teore elektronové hustoty (densty functonal theory) DNA deoxyrbonukleová kyselna ECD elektronový crkulární dchrosmus EOM elektrooptcký modulátor FF slové pole (force feld) FT Fourerova transformace FFT rychlá Fourerova transformace (fast Fourer transform) ICP kruhová polarzace budícího záření (ncdent crcular polarzaton) IČ nfračervený LCP levotočvě kruhově polarzované záření MD molekulární dynamka MP Møllerova-Plessetova poruchová metoda v druhém řádu NMR nukleární magnetcká rezonance PC počítač (personal computer) PCA analýza hlavní komponenty (prncpal component analyss) PLP poly(l-proln) PPII levotočvý polyproln II helx RCP pravotočvě kruhově polarzované záření RNA rbonukleová kyselna ROA Ramanova optcká aktvta SCP kruhová polarzace rozptýleného záření (scattered crcular polarzaton) TFE,,-Trfluoroethanol vac vakuum VCD vbrační crkulární dchrosmus VOA vbrační optcká aktvta Není-l uvedeno jnak, označují písmena řecké abecedy složky kartézských tenzorů. V textu je používána Enstenova sumační konvence, tj. opakují-l se řecká písmena v jednom výrazu dvakrát, sčítá se přes všechny tř kartézské souřadnce. Poznámka k číslování stránek: číslovány jsou pouze stránky textu dzertační práce, nkolv stránky vložených publkací, u kterých je ponecháno jejch vlastní číslování. 4

5 Úvod Jednou ze základních aplkací spektroskopckých technk je výzkum struktury bologckých molekul, neboť objasnění vztahu mez strukturou a funkcí patří k hlavním úkolům bofyzky a molekulární bologe. Mez základní metody strukturní bologe, s nmž je možno studovat systémy s atomovým rozlšením, patří rentgenová dfrakce a nukleární magnetcká rezonance (NMR). První z nch je však možno používat jen na určení struktury monokrystalckých vzorků, naopak u NMR exstuje jsté omezení dané velkostí studovaných systémů. V oblastech, kde výše zmíněné metody nemohou poskytnout hledanou nformac anebo je třeba j určtým způsobem doplnt, nacházejí šroké uplatnění metody vbrační spektroskope: nfračervená (IČ) spektroskope a Ramanův rozptyl. Jejch hlavním výhodam jsou nedestruktvnost a možnost studovat molekuly v jejch přrozeném prostředí, tj. ve vodných roztocích a v závslost na fyzkálních parametrech (ph, teplota, přítomnost ontů apod.). Navíc tyto metody umožňují studovat dynamku strukturních přechodů (doba vbračních přechodů -3 až -4 s je řádově kratší než doba odpovídající nejrychlejším konformačních přechodům). Obě metody vbrační spektroskope se lší jak fyzkálním jevy př jejch vznku a tedy metodam měření, tak různým výhodam a omezením. IČ absorpce umožňuje poměrně snadná měření s malým nároky na množství vzorku. Velkou výhodou Ramanova rozptylu je, že voda má sama o sobě v Ramanově spektru velm slabý sgnál a představuje tedy deální rozpouštědlo. Optcky aktvní (chrální) molekuly se vyskytují ve dvou chemcky totožných ale strukturně odlšných formách, které se vůč sobě mají jako zrcadlové obrazy. Ačkolv různé zomerní formy jedné molekuly hrají v bologckých systémech naprosto odlšnou rol (např. proteny se skládají pouze z L-amnokyseln a v nukleových kyselnách se vyskytují pouze D- cukry), není možné je pomocí běžných metod vbrační spektroskope rozlšt. Velký přínos proto představují metody vbrační optcké aktvty (VOA) přnášející do vbrační spektroskope enantomerní selektvtu. Vbrační optcká aktvta stejně jako vbrační spektroskope sestává ze dvou komplementárních metod vbračního crkulárního dchrosmu (VCD) a Ramanovy optcké aktvty (ROA), které díky tomu, že spojují stereochemckou ctlvost konvenční (elektronové) optcké aktvty s vyšším spektrálním rozlšením a tudíž bohatším strukturním obsahem vbrační spektroskope, mají zvýšenou ctlvost k lokálnímu prostorovému uspořádání atomů a k jejch dynamce. VOA sonduje stereochem molekulárního skeletu přímo, zatímco 5

6 elektronová optcká aktvta sonduje stereochem pouze nepřímo prostřednctvím chromoforu. Hlavní výhodou VOA oprot elektronovému crkulárnímu dchrosmu (ECD) je enormní nárůst stereochemcké nformace obsažené ve spektru, naopak nevýhodou je nízká rotační síla vbračních přechodů ve srovnání s přechody elektronovým. Pro studum bomolekul má ROA výrazně vyšší aplkační potencál. Pomocí Ramanovy (a tedy ROA) spektroskope lze v jednom expermentu snadno zaznamenat vbrační spektra látek rozpuštěných ve vodě v celém rozsahu fundamentálních vlnočtů, což je velká výhoda oprot použtí nfračervených technk. Další výhodou ROA je, že do značné míry snžuje složtost vbračních spekter bopolymerů, neboť nejntenzvnější ROA sgnál odpovídá vbračním souřadncím nejrgdnějších a chrálních částí struktury, což v případě protenů znamená především vbrace peptdové páteře molekuly, zatímco základní nformace o postranních řetězcích je obsažena v odpovídajícím Ramanově spektru. Další výhodu představuje krátkodosahovost nterakcí odpovědných za generac ROA sgnálu, takže pomocí ROA lze studovat na rozdíl od ECD lokální struktury. Přes svůj nesporný potencál není ROA přílš rozšířenou technkou. V mpaktovaných časopsech lze v současnost nalézt pouze práce z laboratoří v Glasgow, Zürchu a z naší laboratoře, a to přes to, že od roku je ROA spektrometr komerčně dostupný. Většímu rozšíření metody brání především značná náročnost expermentu výpočetních postupů. Pomocí ROA spektroskope byla studována na jedné straně celá řada jednoduchých molekul (chrální organcké látky, cukry, amnokyselny), jejchž spektra byla nterpretována na základě ab nto výpočtů. Na druhé straně pro složté bomolekuly jako jsou proteny, nukleové kyselny a vry je strukturní nterpretace spekter založena na čstě emprcké korelac mez spektrálním rysy a známým strukturním motvy. Hlavním cílem předkládané dsertační práce, kromě nezbytného výrazného přebudování ROA spektrometru na Fyzkálním ústavu UK a s tím spojeným rozvojem a standardzací měřících postupů metod zpracování expermentálních dat, proto byla snaha o vyplnění mezery mez studem jednoduchých molekul a složtých bomolekul ve vodných roztocích a o hlubší pochopení jevů ovlvňujících generac ROA sgnálu. Předkládaná dzertační práce je členěna do pět kaptol. V první kaptole jsou zformulovány cíle dzertační práce. Druhá kaptola podává stručný přehled současného stavu Ramanovy optcké aktvty a jejích aplkací s důrazem na studum bomolekul, ve třetí kaptole jsou shrnuty základy teore ROA a metody používané př smulacích ROA spekter. Ve čtvrté kaptole je podrobně popsán ROA spektrometr vybudovaný v rámc řešení dzertační práce na Fyzkálním ústavu Unverzty Karlovy, postupy př ladění aparatury, přípravě vzorků vlastním měření a metody zpracování expermentálních dat (spekter). V páté kaptole jsou 6

7 uvedeny výsledky studa vybraných molekulárních systémů pomocí ROA. Většna dosažených výsledků byla publkována, byla přjata nebo nabídnuta k publkac v mpaktovaných zahrančních časopsech. Reprnty nebo rukopsy těchto prací jsou zařazeny do jednotlvých podkaptol za krátký úvodní text a jsou jejch nedílnou součástí. V závěru jsou shrnuty dosažené výsledky a naznačena perspektva jejch dalšího využtí. 7

8 . Cíle práce Cíle, které s předkládaná práce kladla, lze rozdělt do tří základních okruhů. První okruh tvoří veškeré problémy spojené s výstavbou ROA spektrometru nové generace na Fyzkálním ústavu UK a s metodckým rozvojem, který by umožnl více méně rutnní měření spekter bologcky významných molekul ve vodném roztoku, zejména amnokyseln, peptdů a protenů. Druhý okruh souvsí s budováním výpočetního aparátu pro smulac Ramanových a ROA spekter flexblních polárních látek rozpuštěných ve vodě. Třetí okruh potom na vybraných aplkacích demonstruje použtelnost jak vybudované expermentální základny tak vyvnutých výpočetních metod pro řešení konkrétních problémů. Ramanova optcká aktvta dosud nepatří mez rutnní a rozšířené spektrální technky. V době zadání práce nebyl na trhu komerční spektrometr. Přístupy využívané pro smulace spekter nebyly na takové úrovn, aby pro amnokyselny č jednoduché peptdy dokázaly uspokojvě nterpretovat spektra změřená v roztoku a přspět tak nejen k hlubší než fenomenologcké nterpretac spekter složtějších systémů, ale také k pochopení mechansmů vznku ROA sgnálu v komplexních systémech a k objasnění jeho strukturní ctlvost. Hlavní cíle dsertační práce je tedy možné shrnout do následujících bodů:. Vybudovat ROA spektrometr nové generace, pokrývající dostatečně šroký spektrální obor včetně oblast nízkých vlnočtů (nžších než 6 cm - ), a získat tak nové strukturně ctlvé spektrální okno zahrnující oblast torzních a deformačních vbrací molekulárního skeletu. Vytvořt měřící program přátelský k užvatel zabezpečující všechny potřebné funkce spektrometru a základní zpracování změřených spekter. Provést ověřovací expermenty a vypracovat standardní měřící postupy.. Pro komplexní nterpretac Ramanových a ROA spekter využít pokročlý výpočetní aparát kvantové mechanky včetně metod umožňujících zahrnout do výpočtů realstcké modely rozpouštědla. Snažt se posthnout dynamcké aspekty chování studovaných molekul v roztoku a v smulacích je zohlednt s cílem dosáhnout nejen výrazně lepší shody smulovaných spekter s expermentálním daty, ale také odhalt a vysvětlt spektrální projevy konformační flexblty. Rozvíjet metody smulování spekter složtějších struktur založených na přenosu tenzorů molekulárních vlastností vypočtených pro vhodně zvolené fragmenty a otestovat jejch použtelnost. 8

9 3. Změřt ROA spektra vybraných amnokyseln, peptdů a polypeptdů a na základě provedených výpočtů je detalně nterpretovat. Výše formulované cíle orentovaly dzertační prác v souladu s cíl výzkumného záměru MSM 3 Fyzka bologckých systémů a syntetckých makromolekulárních struktur, který byl řešen v letech 999 až 4, a výzkumného záměru MSM6835 Fyzka molekulárních, makromolekulárních a bologckých systémů řešeného od roku 5. V letech -3 byl tento výzkum také podporován grantovým projektem GA3//3 Teoretcký a expermentální rozvoj Ramanovy optcké aktvty jako stereochemcké sondy pro vodné prostředí (řeštel Petr Bouř, spoluřeštel Vladmír Baumruk). V roce 5 byla tato dzertační práce podpořena projektem GAUK /5 Ramanova optcká aktvta peptdů a protenů (řeštel Josef Kaptán). 9

10 . Ramanova optcká aktvta - přehled současného stavu Ramanův rozptyl je neelastcký rozptyl záření a tedy ze své podstaty dvoufotonový proces, který se vyznačuje navíc poměrně malým účnným průřezem (z 6 rozptýlených fotonů je přblžně jen jeden rozptýlen neelastcky). Ramanova optcká aktvta spočívá v měření rozdílu mez Ramanovým spektry spojeným s odpovídajícím pravo- (RCP) nebo levotočvě kruhově polarzovaným zářením (LCP) (ať už jde o záření budící nebo rozptýlené). Tento rozdíl je však o 3 až 5 řádů menší než součet Ramanových spekter, z čehož vyplývá nutnost velm přesné modulace mez oběma kruhově polarzovaným stavy. Výsledkem měření jsou vždy dvě spektra vlastní ROA, tedy dferenční spektrum I( RCP) I( LCP) a zdrojové Ramanovo spektrum I ( RCP) + I( LCP). RCP LCP záření stejně jako oba enantomery chrální molekuly vykazují vzhledem ke svým protějškům zrcadlovou symetr. Jestlže je pro enantomer (+) defnována optcká aktvta jako I ( + ) = I R ( + ) I ( + ), ze zrcadlové symetre plyne, že opačné spektrum optcké aktvty získáme, použjeme-l opačný enantomer ( ), tedy I ( ) = I( + ) = I R ( ) I ( ). Právě ctlvost optcké aktvty k zrcadlově symetrckým L vztahům mez enantomery chrálních molekul je zdrojem její pozoruhodné schopnost specfkovat absolutní stereochemcké vlastnost chrálních molekul v roztoku (vz obr..). Vbrační spektrum N-atomové nelneární molekuly obsahuje 3N 6 fundamentálních pásů, z nchž každý je spjat s jedním normálním vbračním módem a každý nese nformac o konformac a absolutní konfgurac té část struktury, která se dané normální vbrace účastní. Vbrační optcká aktvta sonduje stereochem molekulárního skeletu přímo, zatímco elektronová optcká aktvta sonduje stereochem pouze nepřímo prostřednctvím chromoforu. Enormní nárůst stereochemcké nformace obsažené ve spektru vbrační optcké aktvty tak představuje jeho hlavní výhodu ve srovnání se spektrem elektronového crkulárního dchrosmu (ECD). Pomocí Ramanovy ROA spektroskope lze snadno zachytt vbrační spektra látek rozpuštěných ve vodě v celém rozsahu fundamentálních vlnočtů, což je velká výhoda oprot nfračerveným absorpčním technkám. Na rozdíl od VCD, které je zpravdla pro bologcké vzorky rozpuštěné ve vodě omezeno na relatvně úzký spektrální obor (např. oblast amdu I a II tj cm - u peptdů a protenů), v případě ROA není problém změřt v jednom L

11 expermentu celý šroký spektrální obor (v našem případě -35 cm - ). Přrozeným objektem zájmu ROA jsou téměř všechny flexblní, bologcky významné molekuly. 8 Raman (I R + I L ) (I R - I L ) ROA ICP Wavenumber (cm - ) D-Ala-D-Ala L-Ala-L-Ala Wavenumber (cm - ) Obr..: Zrcadlová symetre dvou enantometrů alanyl-alannu a jejch spojtost k zrcadlové symetr ROA spekter.. Expermentální přístupy k měření ROA Ramanova optcká aktvta je spojena s kvantovým přechodem mez stejnou dvojcí stavů jako př vbračním crkulárním dchrosmu, což umožňuje přímé srovnání VCD a ROA spekter měřených ve stejném spektrálním oboru. Ramanův rozptyl je však dvoufotonový proces, a proto je ROA ve srovnání s VCD komplkovanější, jak teoretcky, tak expermentálně. Př praktckém expermentálním uspořádání je tak možno volt geometr rozptylu a modulační schéma, to jest polarzac dopadajícího a rozptýleného záření. Geometre rozptylu je charakterzována úhlem mez dopadajícím a rozptýleným zářením; zpravdla měříme přímý ( ), pravoúhlý (nejčastěj užívaný v normální Ramanově spektroskop, 9 ) anebo zpětný (8 ) rozptyl. Pokud jde o modulační schéma, můžeme volt z několka přístupů k měření spekter ROA podle toho, do které fáze rozptylového procesu vstupuje kruhová polarzace (vz obr..).

12 Obr..: Dagram energetckých hladn molekuly a polarzačních stavů dopadajícího a rozptýleného záření u čtyř základních modulačních schémat používaných v ROA. Stokesův proces je znázorněn pro přechody mez vbračním stavy g a g základního elektronového stavu s vrtuálním vbronckým stavem označeným přerušovanou čarou. Podle přjaté konvence se horní ndex vztahuje k polarzac budícího záření a dolní ndex k polarzac rozptýleného záření. Prncpálně nejjednodušší formou ROA je metoda ICP (ncdent crcular polarzaton), která je založena na modulac polarzace budícího záření. V tomto případě potom detekujeme buď polarzované nebo depolarzované případně veškeré rozptýlené záření. Další formou ROA je metoda SCP (scattered crcular polarzaton) u níž je rozptyl buzen lneárně polarzovaným zářením a detekuje se přítomnost pravo- a levotočvě kruhově polarzované složky v rozptýleném záření. U metod DCP I a DCP II (dual crcular polarzaton) je kruhově polarzované zářením budící a v rozptýleném záření detekujeme přítomnost kruhově polarzované složky se shodným (DCP I ) respektve opačným (DCP II ) smyslem kruhové polarzace.

13 Vbrační optcká aktvta byla teoretcky předpovězena na konc 6. let. První úspěšná měření ROA byla provedena v roce 97 L.D. Barronem 3 na zařízení používajícím pravoúhlou geometr, modulac budícího záření (ICP) a skenovací spektrometr. Z teore ROA vyplývá, že geometre zpětného rozptylu je z hledska získaného poměru sgnál/šum nejpříznvější. Až do roku 999 se zdálo, že nejvýhodnější je ICP modulace, na níž byly založeny spektrometry vybudované na Unverztě v Glasgow ve skupně profesora Barrona. 4, 5 Tyto spektrometry umožňují měření šrokého spektra látek od jednoduchých až po komplexní systémy jako jsou např. vry. Podle tohoto zařízení byl v letech vybudován spektrometr na Fyzkálním ústavu MFF UK. 6 Na odlšné strateg byla založena aparatura na Unverztě v Syracusách, 7, 8 kde bylo využto pro nastavení polarzačních stavů jedné nebo dvou čtvrtvlnových destček. Z expermentálního hledska je mnohem flexblnější, neboť umožňuje měření v geometr přímého, pravoúhlého zpětného rozptylu všechny formy ROA (ICP, SCP, DCP I a DCP II ). Toto zařízení bylo podrobně popsáno v prác 7 pro pravoúhlé SCP uspořádání a další vylepšené zařízení využívající zpětného rozptylu a DCP I je popsáno např. v prác. 9 ROA sgnál je pro DCP I a ICP stejný, zatímco odpovídající Ramanova spektra jsou rozdílná, neboť zatímco v ICP měříme totální rozptyl, v DCP I měříme pouze anzotropní rozptyl a v Ramanově spektru tedy chybí polarzované pásy. Z toho vyplývá výhoda DCP I stratege, protože příslušná ROA spektra nejsou tolk náchylná ke vznku polarzačních artefaktů projevujících se především pro slně polarzované pásy. Díky jstým expermentálním omezením však toto zařízení poskytuje as o řád slabší ROA sgnál než aparatura zbudovaná v Glasgow a v mnulost byla použta pouze pro studum chrálních kapaln, amnokyseln a jednoduchých peptdů, které je možno přpravt vysoce koncentrované vzorky. K převratu v desgnu ROA expermentu došlo v roce 999 publkováním orgnální konstrukce Dr. Huga (vz obr..3) umožňujícím měřt v SCP nebo DCP modulac. Spektrometr je navržen tak, aby bylo možno zaznamenávat současně pravo- a levotočvě kruhově polarzovanou složku v rozptýleném záření. Tím je automatcky odečtena šumová složka vznkající tepelným fluktuacem ve vzorku, malým resduálním kolísáním stablty laseru (způsobeným např. průchodem prachové částce laserovým svazkem) apod., tzv. "flcker nose". Šum je v tomto případě jen čstě statstcké povahy a je možno ho vyhlazovacím proceduram (např. Savtzky-Golayovým algortmem) mnmalzovat. To představuje obrovskou výhodu oprot ROA spektrometrům měřícím obě odečítané komponenty v různých časech, neboť zde má šum jnou charakterstku a není možno jej odstrant bez ztráty kvalty spekter (o tomto problému bude podrobněj pojednáno ve 4. kaptole). I přes to, že se jedná o zařízení velce složté, byla v roce frmou BoTools Inc. uvedena na trh jeho komerční 3

14 verze, spektrometr ChralRAMAN. Přístroj také vyžívá pokročlé technky na potlačování artefaktů založené na vytváření "vrtuálních enantomerů". Toto otevírá použtí této dosud mmořádně expermentálně náročné spektroskopcké metody šrokému spektru užvatelů. Vysoce kvaltní spektra protenů o objemu vzorku ~3 µl, koncentrac ~3 mg/ml a výkonu laseru na vzorku ~5 mw je možno na tomto zařízení získat během cca až 5 hodn (což je zhruba desetkrát kratší čas než u našeho ICP přístroje č ROA spektrometru v Glasgow). Je však třeba poznamenat, že měření není patrně rutnní záležtostí an na těchto spektrometrech neboť od uvedení přístroje na trh dosud nebyly publkovány žádné výsledky z jných skupn než z Glasgow. Obr..3: Schéma ROA přístroje umožňující současné měření pravo- levotočvě kruhově polarzované složky rozptýleného záření. Dělené kolo (chopper wheel) na vstupu spektrografu je použto pouze u DCP varanty expermentu (není třeba u SCP). Převzato z práce.. Molekulární systémy studované pomocí ROA Soubor normálních vbračních módů s příspěvky vbračních souřadnc postranních řetězců hlavního řetězce molekuly může být velce komplkovaný. Velkou výhodou ROA metody je, že je schopna pronknout složtost vbračních spekter, neboť nejslnější ROA sgnály jsou často spojeny s vbracem nejpevnějších a zároveň chrálních částí struktury, které určují danou konformac molekuly (na rozdíl od konvenčního Ramanova rozptylu, kdy např. u protenů domnují příspěvky od postranních řetězců). Základním aplkacem ROA spektroskope jsou:. určování absolutní konfgurace optcky aktvních molekul v roztoku,. měření enantomerní 4

15 čstoty (analytcká aplkace velm zajímavá pro farmaceutcký průmysl), 3. studum struktury bomolekul v roztoku. Jednoduché a organcké molekuly Velké množství jednoduchých chrálních látek bylo měřeno v počátcích ROA, a to buď ve formě čstých chrálních kapaln nebo koncentrovaných roztoků. Nejznámější jsou patrně stude terpenových organckých kapaln trans-pnanu a α-pnenu 3-6. Tyto látky byly od počátku používány pro kalbrac a ladění ROA aparatury díky velkému ROA sgnálu. Skupna dr. Huga se složtým organckým látkam zabývá v současnost a pokouší se na nch testovat fundamentální aspekty chralty molekul a různé výpočetní aspekty ROA. Jmenujme např. stude (-)-(M)-σ-[4]Helcenu 7, (4S)-Galaxoldu 8, (4S)-4-methylsochromanu a (4S)-zomeru Galaxoldu 9 a zvláště (R)-[H-(), H-(), H-(3)]-neopentanu. Výzkum těchto "jednoduchých" (bench mark) systémů je tedy stále aktuální a spektra řady z nch nebyla doposud uspokojvě nterpretována. Za všechny uveďme jen jeden příklad a to kyselnu vnnou jako prototypu jednoduchých avšak flexblních systémů. Stručně zmňme ještě jednu velkou skupnu látek, která se v současnost opět dostává do centra pozornost. Jde o sachardy, které jsou pro ROA deálním systémy, neboť poskytují nformatvní vbrační pásy v celém rozsahu fundamentálních vlnočtů. Pomocí ROA byla studována celá řada monosachardů, -4 která poskytla základní databáz jejch rysů v ROA spektrech. Byla studována řada d- a polysachardů, u nchž je pro celkovou konfgurac 5, 6 molekuly určující konformace glykosdcké vazby C-O-C. Amnokyselny Bílkovny žvých organsmů se skládají z amnokyseln. Všechny kromě glycnu, který není chrální, se v přrozených bílkovnách vyskytují v L- formě. Amnokyselny, vyskytující se ve vodných roztocích zpravdla ve formě podvojného ontu, obsahují dvě nabté funkční skupny: amnoskupnu ( NH + 3 ) a karboxylovou skupnu ( COO - ), takže představují deální modelový systém pro studum nterakcí nabtých částí molekuly s rozpouštědlem. Nejjednodušší chrální amnokyselna, L-alann, je současně nejčastěj se vyskytujícím zbytkem v protenových řetězcích. Pro svoj jednoduchost a velm dobrou rozpustnost ve vodě představuje alann vhodný objekt jak pro ROA spektroskop, 7-9 tak pro modelování spekter 5

16 pomocí počítačových smulací. 3-3 Výzkumu alannu se částečně věnována tato práce. V lteratuře lze nalézt ICP ROA spektra jných amnokyseln, jako L-sernu, L-systenu, L-valnu, L-threonnu a L-soleucnu. 33 Poněkud překvapvě dosud nebylo publkováno ROA spektrum L-prolnu. Peptdy a polypeptdy Základním strukturním prvkem peptdů a protenů je peptdová vazba. Jedná se o vazbu (C-N) mez amdovou a karboxylovou skupnou dvou sousedních amnokyseln. Př spojení více amnokyseln tímto způsobem vznká peptdový řetězec. Všech šest atomů peptdové vazby (vz. obr..4) leží přblžně v jedné rovně. Změna konformace hlavního řetězce je umožněna rotací rovn sousedních peptdových vazeb (se společným C α ) kolem vazeb C C α (úhel ψ) a C α N (úhel φ). Peptdové řetězce mohou vytvářet různé typy sekundárních struktur, jak je uvedeno v tab cm cm - 34 cm - Obr..4: Schematcké znázornění tvaru tří základních vbračních módů peptdové vazby, které hrají prvořadou rol př určování konformace protenového řetězce metodam vbrační spektroskope. Vbrace atomů peptdové vazby odrážejí slové poměry a geometr uspořádání hlavního řetězce a hrají tedy př určování konformace protenového řetězce metodam vbrační spektroskope prvořadou rol Schematcké znázornění tří nejdůležtějších vbračních módů peptdové vazby, jejchž frekvence jsou ctlvé ke struktuře hlavního polypeptdového řetězce bez ohledu na postranní řetězce, je znázorněn na obr..4. Vbrace amdu II není v nerezonančních Ramanových spektrech pozorovatelná. Oblast amdu III se konvenčně udávala až do 3 cm -, stude skupny prof. Barrona však ukazuje, že vlnočet těchto vbračních módů sahá až k 34 cm - 35, 36, 38. 6

17 Tab..: Základní typy sekundárních struktur. 39 Typ sekundární Torzní úhel ( ) struktury φ ψ ω Počet jednotek na jednu obrátku Stoupání na amnokyselnovou jednotku [Å] antparalelní β paralelní β α-helx helx π-helx polyproln I helx polyproln II helx Studum peptdů přrozeně představuje nezbytný mezkrok k pochopení struktury bílkovn. Pomocí ROA byly studovány především jednoduché dpeptdy, u nchž bylo možné provádět ab nto smulace. Byly provedeny stude modelových látek jako N-acetyl-N'-methyl- L-alannamd, 4-4 L-alanyl-L-alannu 3, a dalších látek, např. cyclo(l-pro-l-pro). 46 Dále byla pomocí ROA studována závslost konformace alannových olgopeptdů na délce řetězce (Ala až Ala 5 ), která ukázala, že s rostoucí délkou řetězce vzrůstá tendence k tvorbě levotočvého polyproln II helxu (PPII). 47 Je známo, že homopolypeptdy poly(llysn) a poly(l-glutamová kyselna) mění svoj sekundární strukturu v závslost na ph roztoku a teplotě. Slouží proto jako velm vhodné modely základních typů sekundární struktury 34, 48-5 α-šroubovce, β-skládaného lstu a náhodného klubka (random col). Proteny Jak jž bylo uvedeno, výhodou ROA je, že se do značné míry snžuje složtost vbračních spekter bopolymerů, neboť nejntenzvnější ROA sgnál odpovídá vbračním souřadncím nejrgdnějších a chrálních částí struktury, což v případě protenů znamená především vbrace peptdové páteře molekuly. Základní nformace o postranních řetězcích je přtom obsažena v odpovídajícím Ramanově spektru. Další výhodou představuje krátkodosahovost nterakcí odpovědných za generac ROA sgnálu, takže pomocí ROA lze studovat (na rozdíl od ECD) lokální struktury (vlásenky, β-smyčky, krátké úseky šroubovc apod.). Vbrace hlavního peptdovéhořetězce molekuly je možno nalézt ve třech základních oblastech Ramanova spektra 5, 5 : (a) oblast valenčních vbrací páteře molekuly ~87 5 cm - pocházející převážně od valenčních vbračních souřadnc C α C, C α C β a C α N, 7

18 (b) rozšířená oblast amdu III ~3 34 cm - C α N a C α C valenční vbrace kombnované s rovnným deformačním vbracem N H a C α H a (c) oblast amdu I ~6 7 cm - převážně C=O valenční vbrace, vz. též obr..4). Ukazuje se, že právě rozšířená oblast amdu III je pro určování struktury obzvláště důležtá, neboť díky nterakcím mez N-H a C α H deformačním vbracem zde pozorujeme řadu ROA pásů velm ctlvě odrážejících geometr polypeptdového řetězce. Na obr..5a je uvedeno charakterstcké Ramanovo a ROA spektrum albumnu z ldského séra jako typckého zástupce protenů s vysokým obsahem α-helxu. Intenzvní kladný ROA pás 34 cm - je přpsován hydratované formě α-helxu, zatímco méně ntenzvní kladný pás 3 cm - α-helxu v převážně hydrofobním prostředí. 36 Stejné pásy byly pozorovány u jných α-helkálních polypeptdů a globulárních protenů 34, 53, 54 a u protenů obálky neporušených flamentárních bakterofágů 55. Relatvní ntenzta těchto pásů vypovídá o tom, nakolk je daný proten exponován do rozpouštědla. Dalším charakterstckým znakem α-helxu je negatvní 64 cm - a poztvní 665 cm - ROA dublet v oblast amdu I a dále poztvní pásy v oblast cm -. Na obr..5b jsou uvedena spektra konkanavalnu A jako typckého zástupce protenu s vysokým obsahem β-struktury a mnmálním obsahem α-helxu (podle PDB krystalové struktury CNA 43,5% β skládaný lst,,7% α-helx,,3% 3 -helx, zbytek vlásenkové struktury a smyčky). β-struktuře lze přřadt ostrý záporný pás 4 cm -, podobné pásy byly pozorovány v ROA spektrech jných protenů s vysokým obsahem β-struktury, 34, 36, 54 ve kterých se občas vyskytuje jný záporný pás cm -, který je pravděpodobně dalším otskem této struktury, s největší pravděpodobností hydratované. Poztvní pás 95 cm - je možno u konkanavalnu A přpsat vbracím β-smyček. Negatvní-poztvní ROA dublet amdu I cm - je také charakterstckým rysem β-struktur a lze jej snadno rozpoznat od pásů odpovídajících α-helxu, které mají vlnočet nžší o přblžně 5 cm -. Proteny obsahující významnou část β-skládaného lstu obsahují většnou také charakterstcké pásy smyček a ohybů. Negatvní pásy v oblast cm - odpovídají právě ohybům u β-vlásenek. Tato oblast dovoluje rozlšt paralelní a antparalelním β-skládané lsty, neboť pouze antparalelní většnou obsahují vlásenkové struktury (paralelní bývají spojeny převážně α-helkálním strukturam). Mnoho protenů obsahujících β-struktury jeví v ROA spektrech slný poztvní pás v oblast cm - stejně jako neuspořádané formy poly(l-lysnu) a poly(lglutamové kyselny) 34, 49, a lze je přřadt struktuře polyprolnu II. 8

19 Na obr..5c je uvedeno Ramanovo a ROA spektrum slepčího lysozymu jako typckého αβ protenu (podle PDB krystalové struktury lse 8,7% β skládaný lst, 6,% α-helx,,9% 3 -helx) a spektrum také obsahuje charakterstcké rysy obou těchto hlavních struktur. Do oblast pásů 97 3 cm - přspívají významnou měrou také vbrace 3 -helxu a pravděpodobně také pásy z jných zdrojů, jejchž dekonvoluc se doposud nepodařlo provést. 36 Slný poztvní pás 554 cm - odpovídá vbračnímu módu W3 ndolového kruhu tryptofanu, jehož poloha v Ramanových spektrech odráží velkost torzního úhlu χ, popsujícího orentac tryptofanového postranního řetězce vzhledem k hlavnímu řetězc. 56 ROA k tomu přdává ještě možnost určt znaménko torzního úhlu a tedy získat o tomto postranním řetězc kompletní stereochemckou nformac 57 dostupnou jnak pouze pomocí metod s atomárním rozlšením. Obr..5: Typcká Ramanova a ROA spektra základních protenových struktur. (a) albumn z ldského séra: převážně α-šroubovce, (b) konkanavaln A z fazole: β-barel a (c) slepčí lysozym: zastoupeny α β struktury. Převzato z publkace. 58 9

20 Skupna prof. Barrona dále publkovala celou řadu prací zabývajícím se neuspořádaným strukturam a rolí levotočvého polyproln II helxu př msfoldngu. Toto téma je velce aktuální př studu příčn vznku degeneratvních chorob zapříčněných tvorbou plaků apod. 36, 5, 53, 59-6 Na soubor naměřených ROA spekter je také možno aplkovat vhodné statstcké metody jako např. analýzu hlavní komponenty (prncpal component analyss, PCA), které umožňují rozpoznat hlavní společné a rozdílné strukturní vztahy ve zpracovaných spektrech (obr..6). Obr..6: Zobrazení závslost prvních dvou nejvýznamnějších koefcentů z analýzy hlavní komponenty (PCA) souboru 75 ROA spekter polypeptdů, protenů a vrů. Z obrázku se zřejmá jasná separace jednotlvých typů sekundárních struktur respektve shlukování strukturně blízkých protenů. Koefcent dobře popsuje přechod od vysokého obsahu α-šroubovce (vlevo) k vysokému obsahu β-skládaného lstu (vpravo), koefcent zase přechod od slně uspořádaných struktur (dole) k slně neuspořádaným (nahoře). Převzato z práce. 58

21 Nukleové kyselny Řešení struktury a funkce nukleových kyseln je jedním z centrálních témat molekulární bologe. Studum nukleových kyseln pomocí ROA je v současnost stále v počátcích. Z doposud provedených měření se ukazuje, že ROA je ctlvá tř různé zdroje v chrálním uspořádání nukleových kyseln: (a) chrální stohování jnak nechrálních párů bází, (b) chrální povaha glykosdcké vazby C-N mez bází a cukrem a (c) vntřní chralta cukerných cyklů Obr..7: Typcká Ramanova a ROA spektra vybraných nukleových kyseln. (a) dvoušroubovce DNA typu B: konformace cukrů C'-endo, (b) trna v přítomnost ontů Mg + zaujímá kompaktní tercární strukturu tvaru písmene L: šrší rozsah konformace cukrů, (c) trna bez přítomnost ontů zaujímá volnou strukturu jetelového lstu s převažující konformací cukrů C3'-endo. Převzato z práce. 36 ROA pásy v oblast ~9 5 cm - pocházejí od vbrací cukerných řetězců a fosfátové skupny. Do oblast ~ 55 cm - přspívají vbrace cukrů bází a nakonec oblast ~55

22 75 cm - obsahuje charakterstcké pásy bazí odpovídající specfckému stohování (stackng). Typcká spektra nukleových kyseln jsou uvedena na obr..7. Spektra DNA (z telecího brzlíku) a obou RNA (trna Phe, phenylalann specfc transfer RNA, v přítomnost Mg + ontů a bez nch) se lší nejvíce v oblast cukerných řetězců, neboť DNA zaujímá dvoušroubovc typu B (konformace cukerného kruhu C'-endo), zatímco trna dvojšroubovc typu A (konformace cukerného kruhu C3'-endo). Mez ROA spektry obou RNA je rozdíl menší, lší ale také v oblast vbrací cukr-fosfátového řetězce ~9 5 cm -. To lze vysvětlt tím, že trna v přítomnost ontů Mg + zaujímá tercární strukturu tvaru písmene L a cukerné cykly zaujímají šrší rozsah konformací (výsledný ROA sgnál je nízký), zatímco bez Mg + se vytváří otevřený útvar podobný jetelovému lstu 67 s převažující C3'-endo konformací cukrů poskytující výrazný charakterstcký ROA sgnál v oblast vbrací cukr-fosfátového řetězce (negatvní pás 99 cm -, poztvní 48 cm - a negatvní 9 cm - ). Vry Znalost struktury vrů na molekulární úrovn je nesmírně důležtá pro pochopení mechansmu jejch působení. Konvenční Ramanova spektroskope představuje velm užtečnou metodu studa ntaktních vrů na molekulární úrovn, neboť může současně vyšetřovat jak protenovou obálku tak jádro obsahující nukleovou kyselnu. 5 ROA, jež může být použta pro zkoumání vrů nejrůznějších typů včetně vlákntých, helkálních, tyčnkových a kosahedrálních, potom svojí schopností pronknout složtostí zkoumané stuktury jenom zvyšuje význam Ramanovy spektroskope pro strukturní vrolog. Dosud publkovaná ROA spektra různých vrů, 55, 68, například vlákntého bakterofágu fd, vru tabákové mozaky, bakterofágu MS a dalších 69 jenom potvrzují, že ROA jako velm ctlvá konformační sonda nejen poskytuje poměrně detalní strukturní nformac, jným metodam pro vzorky v roztoku obtížně zjsttelnou, ale může být využta pro srovnávací stude. 68 V ROA spektrech domnují pásy z protenových obálek vrů a pomocí statstckých metod (PCA) je možno určt sekundární strukturu hlavních podjednotek, 7 rozsah hydratace α-helxů, případně v příznvém případě konformac postranních řetězců tryptofanu (např. u bakterofágu fd 57 ) v obálkách vrů. U mozakového vru vgny (CPMV, cowpea mosac vrus) se odečtením ROA spektra prázdné kapsdy vru od spektra celého vru (což je přístup, který můžeme nazvat dferenční ROA) podařlo určt konformac RNA jako jednovláknový A-typ 7, což byla velm cenná nformace, kterou z rtg. krystalové struktury není možno získat.

23 3. Smulace spekter Teore Ramanovy optcké aktvty Metody ctlvé na chraltu molekul hrají důležtou rol v mnoha oblastech. Díky rozvoj ab nto výpočetních metod a počítačové technky se však ukazuje, že na základě srovnání expermentálních dat VOA (u nchž je bohatý strukturní obsah vbrační spektroskope ještě rozšířen o stereochemckou ctlvost optcké aktvty) s výsledky získaným pomocí teoretckých smulací je možno určt absolutní konfgurac molekuly v roztoku. 7 Vždy je třeba mít na zřetel, že v kvantově-chemckých výpočtech exstují omezení, která jednoznačné určení konformace (konformací) dané látky znesnadňují. Jde například o použtí konečného souboru bázových funkcí, 7 zanedbání anharmonckých efektů a specfcké nterakce s rozpouštědlem. V této kaptole jsou zmíněny metody používané př smulac ROA spekter a řešení konformačně dynamckých problémů u studovaných systémů. 3. Born-Oppenhemerova aproxmace a separace stupňů volnost Schrödngerovu rovnc pro vlnovou funkc molekuly v nerelatvstckém přblížení lze napsat jako v níž je celkový Hamltonán ˆ TOT H ΨN, n = E N, n ΨN, n, (3.) TOT Ĥ defnován jako Tˆ nuc R h = V ( r, R) = Hˆ TOT A A B> A = Tˆ R M A Z A Z R nuc B AB A e + Tˆ, el r Tˆ + V ( r, R) el r h = m Z A e r A A e + j > j e r j, (3.) kde R je poloha jader, r poloha elektronů, ndexy A a B číslují jádra, a j elektrony, operátor knetcké energe jader, el Tˆ r nuc Tˆ R je operátor knetcké energe elektronů a V(r,R) je potencální energe zahrnující nterakc mez jádry A a B s atomovým čísly Z A a Z B, mez jádry a elektrony a mez elektrony navzájem. Předpokládejme, že je možno celkovou vlnovou funkc rozdělt na součn vlnové funkce jader a elektronů: 3

24 nuc el Ψ ( r, R) = χ ( R) ψ ( r, ), (3.3) N, n N n R kde n a N jsou kvantová čísla pro jádra a elektrony a poloha jader. Elektrony jsou mnohem lehčí než jádra (v případě vodíku 8 ) a v (3.) je tedy možno zanedbat člen A el el nuc [ + ( ψ ).( χ )] A M A ψ, (3.4) n což je podstatou Born-Oppenhemerovy aproxmace. Potom můžeme Schrödngerovu rovnc separovat na jadernou a elektronovou část. V elektronové část Schrödngerovy rovnce pak vystupuje poloha jader R pouze jako parametr: ˆ el el [ T r V ( r, R)] n = ε n ( R A n A N + ψ ) ψ. (3.5) Je-l elektronový problém vyřešen, Schrödngerovu rovnc pro jadernou část χ nuc (R) je možno napsat jako el n nuc nuc nuc [ ˆ ε ( R) ] χ ( R) = E, χ ( R) T R +, (3.6) n N v níž se elektronová energe ε (R), která už v sobě zahrnuje repulz jader, stává potencálem n pro pohyb jader. Pro N jader zahrnuje Schrödngerova rovnce pro jádra (3.6) 3N stupňů volnost, které můžeme pro nelneární molekuly (na které se dále omezíme) rozdělt na 3 translační, 3 rotační a 3N 6 vbračních. Př řešení problému jader je dále vhodné translační, rotační a vbrační stupně volnost oddělt. Separac translačního pohybu je možno udělat jednoduše, neboť TOT Ĥ je translačně nvarantní, transformací počátku do těžště molekuly je možno z celkové knetcké energ oddělt translační pohyb molekuly jako celku. Separace rotačního pohybu je možná jen přblžně (např. díky Corolsovým slám). Pro velké molekuly s velkým momentem hybnost, jako jsou bologcké molekuly, je to však dostatečně dobré přblížení. 73 Souřadnou soustavu svázanou s molekulou zpravdla volíme pomocí Eckartových podmínek. První a druhá Eckartova podmínka specfkuje, že př pohybu jader nevznká celkový translační nebo rotační pokyb: kde A= R A je rovnovážná poloha jádra A a N m A N n N N R =, m R R =, (3.7) A A= A A A R A jeho vbrační odchylka. Podrobnou dskuz o separac vbračního a rotačního pohybu lze nalézt např. v monograf. 73 N 4

25 5 3. Harmoncká aproxmace a zavedení normálních vbračních módů Potencál pro pohyb jader ) (R n ε v rovnc (3.6) je možno rozvnout do Taylorovy řady: ( ) ( )( ) K K K = = = = = z y x N K J K K J J K J z y x N J J J J N N n R R R R R R R R R,,,,,,,,,,,,,,, ),, ( ),, ( β α β β α α β α α α α α ε ε ε ε R R R R (3.8) První člen je možno položt rovno nule, pro rovnovážnou polohu jader je R / ε rovno nule, první nenulový člen je až kvadratcký. V harmoncké aproxmac zanedbáváme všechny další členy, takže je možno vbrační část Schrödngerovy rovnc jader napsat jako ) ( ) ( ) ( ˆ 3, 3 R R R H VIB n n n N j j n j N n E X X f X M φ φ φ = + = = = h, (3.9) kde j n n j X X f = ε (3.) je kartézská slová konstanta, prvek v matc slového pole (FF - Hessán). Rovnc (3.9) je možno vyřešt transformací kartézských souřadnc do normálních módů Q k : N k X S Q N j j kj k 3,,,, 3 K = = =, (3.) takže = = = N k k k N j j n j Q X X f 3 3, ω a = = = N k k N Q X m 3 3 (3.) a vbrační hamltonán v rovnc (3.9) bude možno napsat jako = = = + = N j j N j j j j Q Q 3 3 ˆ ˆ H H VIB ω (3.3) Rovnce (3.) defnuje 3N normálních módů Q, zatímco vbračních stupňů volnost je pouze 3N 6. Pro módy odpovídajících translacím a rotacím je však = k ω. Celkovou vlnovou funkc z rovnce (3.6) je možno vyjádřt jako součn vlnových funkcí závslých na jedné normální vbrační souřadnc = = 6 3 ) ( N j j j n Q ϕ ψ (3.4) a jednotlvé rovnce, na něž se Schrödngerova rovnce rozpadne budou:

26 Ĥ jϕ j = + n j hω jϕ j. (3.5) S-matc defnovanou v rovnc (3.) obdržíme tak, že spočteme matc slového pole (3.) a tu pak dagonalzujeme, takže S-matc lze vypočíst ze vztahů (3.) a (3.). 3.3 Teore Ramanovy optcké aktvty V tomto oddíle budou uvedeny výrazy nutné pro pops různých forem ROA. Na počátku je nutno uvést výraz pro ntenztu I Ramanova rozptylu souboru molekul, jejchž referenční poloha pro roztok je zprůměrována přes všechny možné orentace vzhledem k laboratorní soustavě. Polarzační vektory budícího a rozptýleného záření se vztahují k laboratorní soustavě a označme je e a e d. Potom je I ( e ~ d, ~ e ) = 9K e~, (3.6) d* ~ ~ α aαβ eβ kde dolní ndexy označují kartézské složky tenzorů (používáme Enstenovu sumační konvenc, vlnovka značí komplexní číslo). Lomené závorky značí středování přes rotace molekuly, konstanta K je ~ () ω µ E K = 9 4, (3.7) π R kde ω je úhlová frekvence rozptýleného světla, µ je magnetcká permeablta, ~ () E je velkost vektoru elektrckého pole budícího záření a R je vzdálenost od bodu rozptylu k detektoru Měřt absolutní hodnotu ntenzty Ramanova rozptylu je ale velm obtížné, proto se často místo faktoru K používá jná vhodná konstanta. Ve výrazu (3.6) je uvedena komplexně sdružená hodnota polarzačního vektoru rozptýleného fotonu, neboť reprezentuje ems a nkolv absorpc. Obecný výraz pro komplexní Ramanovův rozptylový tenzor a ~ αβ se skládá z tenzoru elektrcké dpólové polarzovatelnost a dále pak tenzorů Ramanovy optcké aktvty (kvadrupólová a magnetcká polarzovatelnost): 74 d d a~ = ~ + n G ~ + n ~ γβ + ( n A ~ n ~ αβ αβ ε γδβ δ αγ ε γδα δ ω γ α, γβ ω γ β,γα ) α, (3.8) c 3 kde ε γδα je Lev-Cvtův jednotkový antsymetrcký tenzor třetího řádu, ω je úhlová frekvence budícího záření a n a n d jsou vektory šíření budícího, resp. rozptýleného záření.zde uvedený obecný výraz rozlšuje rol vstupujícího a rozptýleného fotonu a je ho tedy možno použít v případě rezonančního a prerezonančního Ramanova rozptylu. 6

27 Obr. 3.: Dagram geometre rozptylu, kde ξ je úhel rozptylu (měřeno od směru šíření dopadajícího svazku), úhlyθ a φ jsou úhly polarzace (hlavní osy polarzační elpsy) pro dopadající a rozptýlené záření. Tenzory uvedené v rovnc (3.8) jsou tedy: tenzory elektrcké dpolové polarzovatelnost (α), magnetcké dpólové-elektrcké dpólové optcké aktvty ( G ~ αβ, ~ αβ ), elektrcké dpólové-elektrcké kvadrupólové polarzovatelnost ( A ~ α, βγ, ~ αβ ): ~ α αβ = h α β β α + j m, n ω jn ω + Γ j ω jm + ω + Γ j m ˆ µ j j ˆ µ n m ˆ µ j j ˆ µ n (3.9a) G ~ αβ = h m ˆ µ α j j mˆ β n m mˆ β j j ˆ µ α + j m, n ω jn ω + Γj ω jm + ω + Γj n (3.9b) A ~ ~ m mˆ α j j ˆ µ β n m ˆ µ β j j mˆ α n αβ = + (3.9c) h j m, n ω jn ω + Γj ω jm + ω + Γj α, βγ = h m ˆ µ j j Θˆ n m Θˆ j j n α βγ βγ ˆ µ α + (3.9d) ω ω + Γ ω + ω + Γj j m, n jn j jm kde ω jn ω ω m Θˆ ~ j j n m j j Θˆ βγ ˆ µ α ˆ µ α βγ n αβ = + (3.9e) h j m, n ω + Γ + + Γ jn ω j ω jm ω j ω = j n a jm j m = ω ω jsou úhlové přechodové frekvence mez stavy j a n nebo m. Γ j je šířka elektronové hladny j a je nepřímo úměrná jeho době žvota. Počáteční stav je n a konečný m, takže ω mn = ω ω značí změnu úhlové frekvence (Ramanův posuv). Operátory m n 7

28 8 elektrckého dpólového, magnetckého dpólového a elektrckého kvadrupólového momentu jsou defnovány jako: = k k r k e α α µˆ, (3.a) = k k k k k p r m e m γ β α ε αβγ ˆ, (3.b) ( ) = Θ k k k k k r r r e αβ β α αβ δ 3 ˆ, (3.c) kde δ αβ je Kroneckerovo delta, sčítá se přes všechny částce v molekule, které mají náboj e k, hmotnost m k, polohový vektor r k a moment hybnost p k. Označíme-l kartézské složky vektorů v laboratorní soustavě velkým římským písmeny a složky v soustavě spojené s molekulou řeckým písmeny, pak je výraz pro výslednou ntenztu středovanou přes všechny možné orentace molekul v molekulární souřadné soustavě dán jako ( ) [ ] = ε δ γ β α γδ ε ρδγ δε γ γρ ρδε αβ δ γ β α γδ αβ ω ε ω ε α α α E D C B A * ρε d D D D d C B d A D C B A D d C B d A d l l l l l n A G n e e e e c l l l l e e e e K e e I *, *, * * * * * * * ~ 3 ~ ~ 3 ~ ~ ~ ~ ~ ~ Im ~ ~ ~ ~ ~ ~ Re 9, ~ (3.) kde symbol l Aα je směrový kosnus mez laboratorní souřadncí A a souřadncí v molekulové soustavě α. Ramanův rozptyl je dvoufotonový proces, ntenzta Ramanova rozptylu I je tedy určena polarzačním stavy dopadajícího a rozptýleného fotonu (horní ndexy resp. j). Pro elptcky (nebo lneárně) polarzované záření je úhel mez hlavní polarzační osou a vertkálním směrem reprezentován úhlem θ pro dopadající záření a úhlem φ pro záření rozptýlené, úhel rozptylu je pak ξ, jak je znázorněno na obr. 3.. Intenztu rozptýleného záření je pro danou geometr a polarzační stavy záření možno vyjádřt několka různým způsoby. Dále je stručně nastíněn formalsmus využívající Muellerovy matce. Intenztu rozptýleného záření je dána jako: ( ) ( ) ( ) = = = 3,,, J I J IJ d I T d d S M S K K I S M S ξ φ θ, (3.) kde S je Stokesův vektor a M je Ramanova/ROA Muellerova matce. Čtyř komponenty Stokesova vektoru jsou dány jako

29 S S P cos χ cos ψ S = =, (3.3) S P cos χ sn ψ S3 P sn χ sn ψ kde S je celková ntenzta světelného svazku, P je stupeň polarzace od do a úhly ψ a χ značí azmut a elptctu podle defnce na obr. 3.. S reprezentuje rozdíl v ntenztě mez vertkálně a horzontálně polarzovaným zářením, S reprezentuje rozdíl mez zářením polarzovaným podél úhlů ±45 a konečně S 3 je rozdíl v ntenztě mez pravo- a levotočvě kruhově polarzovaným zářením. Obr. 3.: Polarzační elpsa pro záření pohybující se ve směru osy Z. Úhel ψ je azmut a χ elptcta. Muellerova matce je matce 4 4, jejíž jednotlvé komponenty jsou složté výrazy a obsahují nvaranty tenzorů polarzovatelnost a optcké aktvty (velčny standardně používané v teor Ramanova rozptylu 74 ) a je možno je nalézt v lteratuře. V Muellerově matc dále vystupuje úhel rozptylu ξ. Pro ICP ROA strateg realzovanou bez polarzace rozptýleného záření (označováno někdy jako "unpolarzed" nebo "total" ICP) jsou Stokesovy vektory dány jako : ( ) T d ± S = ( ) T S = (3.4) a příslušná ntenzta Ramanova rozptýleného záření: I K ( ξ ) ( M M 3 ), (3.5) R, L u = ± kde M a M 3 jsou prvky Mullerovy matce. Odpovídající součet crkulárních ntenzt (CIS) a jejch rozdíl (CID) je tedy možno vyjádřt jako I R u ( I + cosξ ξ ) L 4K ( ξ ) I u ( ξ ) = I 3 sn, (3.6a) c 9

30 I R u ( R ξ ) L ( ξ ) + I ( ξ ) = K R3 sn, (3.6b) u kde konstanty jsou složté kombnace tenzorových nvarantů a je možno je nalézt v lteratuře, stejně tak jako ntenzty Ramanova rozptylu pro jné stavy polarzace záření. Nerezonanční aproxmace Pro energe dopadajícího záření dostatečně vzdálené od energe absorpčních přechodů, tj. v tzv. nerezonanční aproxmac, se uvedené vztahy pro ntenztu Ramanova rozptylu podstatně zjednoduší. V tomto přblížení obecně komplexní tenzory polarzovatelnost a oba elektrcké kvadrupólové tenzory optcké aktvty budou mít jen reálnou složku, zatímco magnetcký dpólový tenzor optcké aktvty bude čstě magnární. Komplexní tenzory lze separovat na reálnou a magnární část jako: T ~ = T T. (3.7) Pro Stokesův rozptyl máme tedy A ( n ˆ µ α j j ˆ µ β n ) α βα ω jn α αβ = Re = h ω ω G j n = jn ω αβ µ α h j n ω jn ω = ω Im ( n ˆ j j mˆ n ) ( n ˆα j j Θ βγ n ) = Aα, γβ jn α, βγ Re µ ˆ h j n ω jn ω β (3.8a) (3.8b) (3.8c) a v nerezonančním přblížení zůstávají tyto tenzorové nvaranty β ( α) = 3 ( α α α α ) αβ αβ αα ββ ( α αβ G α G ) β ( G ) = 3 αβ αα Hledané výrazy pro CIS a CID jsou pak rovny: β ω α αβ ε αγδ γ, δβ ββ (3.9a) (3.9b) ( A ) = A (3.9c) α = ααα a G = G αα. (3.9d) 3 3 ( D α D β ( ) I ( R) + I( L) = 4K + α (3.3a) ) ( D α G + D β ( G ) + D β ( ) 8K I( R) I( L) = A) (3.3b) c 3

31 kde koefcenty D -D 5 závsí na zvoleném expermentálním uspořádání a jsou uvedeny v tabulce 3.. Tab. 3.: Hodnoty koefcentů D -D 5 v rovncích (3.3) popsujících CID a CIS ntenzty. Indexy u typů modulace značí u-nepolarzovaný, p-paralelní polarzace, d-kolmá polarzace, *-polarzace pod magckým úhlem. ξ Typ D D D 3 D 4 D 5 ICP u SCP u DCP I DCP II 6 9 ICP p 45/ 7/ 45/ 7/ ½ ICP d ICP* 45/3 /3 45/3 /3 SCP p 45/ 7/ 45/ 7/ ½ SCP d SCP* 45/3 /3 45/3 /3 DCP I 45/4 3/4 45/ 3/ -/ DCP II 45/4 3/4 8 ICP u SCP u DCP I 6 4 DCP II 45 Pro zjednodušený model polarzace vazeb 75 se uvedené vztahy v případě dealzovaných = a osově symetrckých vazeb ještě dále zjednoduší (neboť v tomto případě β ( G ) β( A) α G = ) a pro metodu ICP dává uspořádání ve zpětném rozptylu oprot pravoúhlému uspořádání čtyřkrát větší CID sgnál. Poměr sgnál/šum je v případě zpětného rozptylu krát větší. Dobu měření nutnou na získání stejně kvaltních spekter je tak oprot pravoúhlému uspořádání možno zkrátt až osmkrát. 75 Z uvedených vztahů také vyplývá, že v geometr zpětného rozptylu dávají všechny tř metody ICP u, SCP u a DCP I stejný CID sgnál, první dvě jmenované dávají navíc stejný CIS sgnál. V kaptole jsou porovnány expermentální aspekty jednotlvých metod. 3.4 Ab nto metody výpočtu ROA ntenzt Interpretace ROA spekter byla v centru pozornost už od doby, kdy byla naměřena první spektra. Byly vyvnuto několk zjednodušujících modelů, z nchž nejznámější je 3

32 pravděpodobně "dvojskupnový" model polarzace vazeb. 76 Obecně je však teore ROA velm komplexní a příklady umožňující jednoduchou kvaltatvní nterpretac ntenzt ROA pásů jsou vzácné. V současnost však pokroky ve výpočtech molekulárních vlastností pomocí ab nto metod dovolují přímý výpočet pozorovatelných velčn ROA pro relatvně velké molekuly. Vztahy pro tenzory uvedené v předchozí sekc lze použít pro Ramanův Rayleghův rozptyl. Pro Ramanův a ROA rozptyl je nutno navíc vyjádřt jejch varac v závslost na pohybu jader, tj. alespoň první dervac podle normálních vbračních souřadnc. Pro fundamentální přechody, to jest přechody ze základního stavu do prvního exctovaného vbračního stravu p (kde p je p-tý vbrační mód), se zajímáme o matcové elementy α. Pro vyjádření těchto velčn obvykle používá Placzekova aproxmace, 77 ve které se vbrační vlnová funkce aproxmuje vlnovou funkcí harmonckého osclátoru ααβ m ( ) v α αβ ( Q) nv = ααβ δ m n + mv QP nv + L (3.3) v v P QP a v rozvoj podle vbrační souřadnce zanedbáme členy s vyšší než první mocnnou vbrační souřadnce. První člen ve vztahu (3.3) popsuje Rayleghův rozptyl, druhý vbrační Ramanův rozptyl v harmoncké aproxmac (s výběrovým pravdlem m n = ± ). Pro fundamentální v v přechody P spojené s normální vbrační souřadnc Q P jsou pak tenzory nutné pro výpočet CID nvarantů dány jako: ααβ ααβ α αβ p p ααβ = (3.3a) ω p Q p Q p α αβ Gαβ α αβ p p Gαβ = (3.3b) ω p Q p Q p ααβ Aγδβ α αβ p p εαγδ Aγδβ = ε αγδ (3.3c) ω p Q p Q p Nahradíme-l těmto výrazy hodnoty uvedené ve vztazích (3.8-3), dostaneme konečné vztahy pro ntenztu Ramanova rozptylu a ROA. Dervace tenzorů je samozřejmě možno provádět podle kartézských souřadnc a ty pak přímou lneární transformací převést na dervace podle normálních vbračních módů. α Q αβ j = α X αβ X Q j = α X αβ s j (3.33) 3

33 To pak praktcky umožňuje počítat slové pole (3.) (a tedy normální souřadnce) na jné úrovn než dervace polarzovatelností a tenzorů optcké aktvty (3.3). Dervace tenzorů A a G' jsou závslé na počátku souřadnc A α, βγ X j ε G X αβ j ε A ( COM ) = X G αβ ω j α ( COM ) = ( DOG) ε βγδ Rγ (3.34a) X X α, βγ j ε j ε 3 ( DOG) + R j β α X αγ j ε + R j γ α X αβ j ε αδ j ε R j δ α X αδ j ε δ βγ, (3.34b) kde (COM) značí společný a (DOG) dstrbuovaný počátek souřadnc (typcky v jádře j s pozčním vektorem R j ). Hodnoty v DOG můžeme chápat jako vntřní "chraltu" atomů, kterou nelze redukovat změnou počátku souřadnc. Zanedbání těchto hodnot je podstatou tzv. polarzačního modelu, u něhož dostaneme dervac tenzorů ve společném počátku pouze z dervace polarzovatelnost α. 5 Tenzory polarzovatelnost a optcké aktvty mmo rovnc (3.8) je možno vypočítat pomocí závslost molekulových orbtalů na vnějším elektrckém (F) a magnetckém pol (B) φk (feld-perturbed molecular orbtals, φ k ( Fβ ) = apod.). Tenzory je pak možno vyjádřt jako F β α = αβ 4 φk ˆ µ α φk ( F β ) (3.35a) k G = αβ 4h ω Im φk ( Fα ) φk ( Bβ ) (3.35b) k A = Θˆ α, βγ 4 φ k βγ φk ( Fα ). (3.35c) k Praktcké výpočty tenzorů optcké aktvty byly po dlouhou dobu prováděny programem DALTON 78 a CADPAC, ve kterých byla pro uvedené výpočty mplementována pouze HF metoda. Nová verze programu DALTON 79 z roku 5 obsahuje také DFT metody, ta ale v této prác nebyla použta. Většna provedených smulací tenzorů optcké aktvty byla spočtena pomocí programu Gaussan 3, 8 ve kterém jsou dervace zmňovaných tenzorů mplementovány od roku 4 na HF DFT úrovn. Př konečném výpočtu spekter je nutno vzít ještě do úvahy populac stavů účastnících se přechodů. 8 Pro daný vbrační mód j pak dostaneme: 33

34 I d 4 ( ν ν j ) I ν j hν j exp kt d (3.36) Př zobrazování smulovaných spekter bylo použto Lorentzovské rozšíření čar, takže vzorec pro celkovou ntenztu v každém bodě smulovaného spektra je dán jako: 3N 6 I( ν ) = I d (3.37) j= ν ν j 4 + σ kde ν j je vypočtená vbrační frekvence daného módu a σ pološířka pásů. 3.5 Teore elektronové hustoty (DFT) Elektronová vlnová funkce popsující n-elektronovou molekulu je závslá na 3n prostorových a n spnových souřadncích. Schrödngerova rovnce pro elektrony (3.5) obsahuje pouze jedno- a dvouelektronové prostorové výrazy, takže celkovou energ je možno v nejjednodušším případě (HF) vyjádřt pomocí ntegrálů, které obsahují šest prostorových souřadnc. Z tohoto úhlu pohledu se zdá, že vlnová funkce obsahuje jstou nadbytečnou nformac bez přímé fyzkální nterpretace. To povzbudlo hledání funkce, která by obsahovala méně proměnných než vlnová funkce, ale kterou by bylo přesto možno použít na výpočet energe a dalších vlastností molekul, tj. přejít od vlnové funkce k elektronové hustotě. ψ ( r, r, K, rn ) ρ( r) (3.38) V roce 964 Hohenberg a Kohn ukázal, že u molekul s nedegenerovaným základním stavem je možno popsat energ základního stavu, vlnovou funkc a všechny další vlastnost molekul pomocí jednoznačně určené elektronové hustoty ρ (x,y,z) jako funkce pouze tří souřadnc, tj. energe základního stavu je funkconálem elektronové hustoty E = E[ ρ ]. To je podstatou Hohenbergova-Kohnova teorému 8 Pomocí rovnce (3.5) můžeme E rozepsat jako: takže E = E ρ ] = T [ ρ ] + V [ ρ ] + V [ ] (3.39) v [ Ne ee ρ Operátor potencální energe elektronů a jader je n Z Vˆ α Ne = v( r ), kde v( r ) =, (3.4) r = α α 34

35 V Ne = n ψ v( r ) ψ = ρ( r) v( r) d r (3.4) = a energ základního stavu je možno napsat jako E = Ev [ ρ ] = T [ ρ ] + ρ ( r ) v( r)dr + Vee[ ρ ] = ρ ( r) v( r)dr + F[ ], (3.4) ρ kde funkconál F není závslý na vnějším potencálu (potencálu jader). Tvar tohoto funkconálu není dosud znám, takže rovnc (3.4) není možno přímo použít. Hohenberg a Kohn navíc ukázal pro nedegenerované základní stavy molekul, že pro každou funkc splňující podmínku ρ ( r) dr = n a ρ ( r) pro všechna r (3.43) zk zk platí nerovnost E [ ρ ], jným slovy elektronovou hustotu základního stavu je možno E v zk nalézt varací energe podle funkce elektronové hustoty δe[ ρ] =. (3.44) δρ Levy rozšířl tento teorém na degenerované stavy molekul. 83 Přímý výpočet hustoty z (3.4) je ovšem velce nepřesný. Kohn a Sham ukázal, jak je možné nalézt přesnější ρ když zavedeme umělou vlnovou funkc ve tvaru Slaterova determnantu (respektujeme nejjednodušším možným způsobem požadavek antsymetre vlnové funkce), kde ϕ (r) jsou prostorové část jednoelektronových vlnových funkcí P ψ ( r, L, rn ) = ( ) P{ ϕ( r ) σ Lϕ n ( rn ) σ n} (3.45) n! P kde σ označuje spnovou část jednoelektronové vlnové funkce, sčítá se přes všechny možné permutace P. Jednoelektronová hustota je pak dána vtahem celkovou energ je pak možno napsat jako n ρ ( r) = ϕ ( r), (3.46) j= j n h ρ( r) ρ( r' ) E KS = ϕ k k ϕ k + ρ( ) v( )d + d d + E m r r r r r' r r' e k = XC [ ρ] (3.47) kde první člen je knetcká energe elektronů T [ ρ( r)], druhý potencální energe jader a elektronů, třetí potencální energe elektronů. Problematcký je čtvrtý člen tzv. výměnná energe E XC. Z adabatckého teorému plyne, že v prncpu exstuje funkconál E XC[ρ] takový, že KS energe může být rovna energ dané exaktním řešním Schrödngerovy rovnce. Funkce s 35

36 E XC[ρ] však není známa a neexstuje an postup, jak j systematcky zlepšovat to je hlavní úloha současné teore DFT. Provedeme-l varac δeks [ ρ( r)] δts[ ρ( r)] ρ( r') δe XC[ ρ( r)] = + v( r) + dr' δρ( r) δρ( r) +, (3.48) r r' δρ( r) z podmínky extrému pak dostáváme Kohn-Shamovy rovnce Hˆ ρ( r') = + r + + ) ε ϕ, =, L, n, (3.49) r r' KSϕ v( ) dr' v XC ( r) ϕ ( r = které se řeší běžnou terační metodou. v XC (r) je lokální potencál defnovaný rovncí δe [ ρ( r)] v ( r) XC XC =. (3.5) δρ( r) Přpomeňme ještě, že v "pravé" DFT by se mělo pracovat s funkcí elektronové hustoty (závslé na třech souřadncích) a ne s molekulovým orbtaly a mnmalzovat E [ρ]. Protože ale tento funkconál není znám, řeší se Kohn-Shamovy rovnce pro jednotlvé elektrony. Tyto rovnce tedy představují určtý komproms v původní myšlence DFT. Podobně jako u HF teore je možno KS orbtaly vyjádřt jako lneární kombnac atomových orbtalů (LCAO). Tato formulace DFT se ukázala jako velce užtečná a bylo vyvnuto několk stovek funkconálů E XC s cílem přblížt se realtě. Z praktckého hledska dávají moderní funkconály lepší výsledky než HF metoda. V některých případech může být výpočet DFT dokonce rychlejší než HF. Výměnná korelační energe E XC v sobě zahrnuje několk komponent: knetckou korelační energ, výměnnou energ E X, Coulombovu korelační energ E C. Často je tedy výhodné j rozdělt a hledat funkconály odděleně. E [ ρ( r)] = E [ ρ( r)] + E [ ρ( r)]. (3.5) XC X V rámc "čsté" (pure) DFT je E XC je funkcí hustoty nebo jejích dervací E ( ρ, ρ, ρ). Čsté funkconály se dělí na lokální (local) závslé jen na hustotě v daném bodě E (ρ), mez něž patří např. aproxmace lokální hustoty (local densty approxmaton LDA, v případě otevřených slupek je to spnová aproxmace lokální hustoty local spn densty approxmaton LSDA). Hohenberg a Kohn ukázal, že pokud se ρ mění pomalu se souřadncí, je možno funkconál E XC lze vyjádřt ve tvaru C XC XC 36

37 E [ ρ( r)] = ε ( r) ρ( r) d r, (3.5) LDA XC kde ε XC (r) je lokální potencál zahrnující výměnné a korelační efekty. Výměnná a korelační část funkconálu je uvedena v tabulce 3.. Výměnnou korelační energ E XC je možno hledat také ve formě, kdy obsahuje gradent elektronové hustoty, což je podstatou zobecněné gradentové aproxmace (GGA generalzedgradent approxmaton), občas také nazývané jako ne-lokální (nonlocal) E GGA XC α β α β ( ρ ( r), ρ ( r), ρ ( r), ρ ( r) ) α β XC [ ρ, ρ ] = f dr (3.53) kde α a β označují funkce elektronové hustoty pro elektrony s různým spnem. Tab. 3.: Výměnné funkconály mplementované v programu Gaussan3 8 : Zkratka Název Pops Samostatně V kombnac Slater 4 / 3 ρ, výměnná část LSDA HFS S 4 / 3 X αρ Xalpha XA Ref. 8, 84, 85 8, 84, 85 Becke 88 obsahuje Slaterův výměnný funconál s HFB B korekcem obsahujícím gradent hustoty 86 PW9 Perdew-Wang 9 PW modfkovaný Baroneho modfkace MPW PW9 9 Gll 96 G96 9 PBE Perdew, Burke, Ernzerhof PBE 93, 94 OPTX Handyho modfkace Beckeho funkconálu O 95 Tab. 3.3: Korelační funkconály Název Pops Ref. VWN Vosko, Wlk, Nusar korelační funkconál III splňující RPA řešení rovnoměrného elektronového plynu. Často nazýván jako LSD korelační funkconál 96 VWN5 Jako předchozí ale splňující Ceperly-Alderovo řešení rovnoměrného elektronového plynu (funkconál V). 96 LYP Lee, Yang, Parr, obsahuje lokální nelokální členy 97, 98 PL Perdew, lokální funkconál 99 P86 Perdew 86, PL doplněný o gradentové korekce PW9 Perdew, Wang 9, gradentové korekce 87-9 B95 Beckeho τ-závslý nelokální funkconál (defnován pro hybrdní funkconály) PBE Nelokální funkconál Perdew, Burke, Ernzerhof 93, 94 37

38 Tab. 3.4: Ostatní funkconály používané samostatně Název Pops Ref VSXC Voorhs, Scusera, τ-závslý nelokální korelační funkconál HCTH Handyho funkconály zobecněné gradentové aproxmace: HCTH93, HCTH47, HCTH Nahrazení HF výměnné energe nějakou jednoduchou analytckou funkcí hustoty se však často ukazuje málo přesné, proto jsou konstruovány hybrdní (hybrd) funkconály, jejchž částí je HF výměnná energe: n n HF KS KS KS KS E X = ϕ () ϕ j ()/ r ϕ j () ϕ (), (3.54) 4 = j= doba výpočtu v takovém případě ovšem nemůže být kratší než HF výpočet. Neznámější jsou as tříparametrové Beckeho hybrdní funkconály, které se uvádějí ve formě 6 : E XC = ae + ( a) E + be + E + ce (3.55) Slater X HF X Becke X VWN C non local C a dále exstují tř verze s různým nelokálním korelačním funkconálem (první tř funkconály v následující tabulce): Tab. 3.5: Hybrdní funkconály B3LYP Tříparametrový Beckeho hybrdní funkconál (3.55): ce = ce + ( c) E non local LYP VWN C C C 6 B3P86 non local Tříparametrový Beckeho hybrdní funkconál (3.55): E = E C P86 C 6 B3PW9 BB95 BLYP MPWPW9 B98 PBEPBE BHandH BHandHLYP Tříparametrový Beckeho hybrdní funkconál non local (3.55): E = E C PW 9 C 6 Beckeho jednoparametrový hybrdní funkconál Modfkace BB95 s korelačním funkconálem LYP Modfkace BB95 používající modfkovaný Perdew-Wangův výměnný a Perdew-Wangův 9 korelační funkconál Beckeho revze z roku 998 funconálu B97 Hybrdní funkconál Perdew, Burke Ernzerhof 997. Používá vážení 5% výměnný a 75% korelační funkconál HF LSDA LYP,5E X +, 5E X + EC 8 HF LSDA Becke88 LYP,5E X +,5E X +,5E X + EC 8, 7 9 8,

39 Emprcké parametry umožňují vlastnost jednotlvých funkconálů vhodně "nastavt" podle systému, pro který jsou určeny. Mnoho autorů proto nepovažuje tyto metody za ab nto, když je třeba uvést, že počet volených parametrů je poměrně malý (obvykle 3) a jsou stejné pro všechny typy atomů. Parametry volí zpravdla podle expermentální slučovacích tepel dvouatomových molekul nebo podle onzačních energí vzácných plynů. Matematcké výrazy vyskytující se v DFT potencálech jsou často přílš složté na to, aby je bylo možné spočítat analytcky, např. v báz Gaussových funkcí. Proto se ntegrály vyskytující se př řešení KS rovnc počítají numercky, zpravdla pomocí ntegrace na mříž (grdu) uspořádané sfércky podle atomových jader. Výsledek výpočtu je pak ovlvněn kvaltou této numercké ntegrace a závsí na mplementac v konkrétním programu. Většna programů umožňuje měnt kvaltu mříže, např. počet radálních bodů (radal grd), hustotu bodů na koulích centrovaných okolo jednotlvých atomů (sphercal grd) apod. 3.6 Modely rozpouštědla Ukazuje se, že zahrnutí modelu rozpouštědla do kvantově chemckých smulací je naprosto nezbytné, a to zvláště u bologckých molekul, u nchž voda jako velm polární rozpouštědlo hraje klíčovou rol. K problematce zahrnutí rozpouštědla je možno přstupovat dvěma rozdílným způsoby. Přímočaré je explctní zahrnutí molekul vody do výpočtu. To však sebou nese různé komplkace, např. uvážíme-l, že výpočetní náročnost kvantově-chemckých smulací roste velm rychle s velkostí systému. Navíc jednotlvé molekuly vody mohou specfcky ovlvnt studovanou molekulu (konformačně, změnou slového pole), takže je často nutno smulovat mnoho různých konfgurací vody a délka výpočtu se tak prodlužuje. Aby bylo možno vyhnout se uvedeným obtížím, byly konstruovány kontnuální modely rozpouštědla, které budou rozebrány v následující sekc. Uveďme ještě, že v této prác byly na smulac spekter použty a následně porovnány oba přístupy, jak explctní zahrnutí molekul rozpouštědla, tak kontnuální modely rozpouštědla. Onsagerův model Onsagerův model je hstorcky nejstarším modelem rozpouštědla. - Molekuly rozpouštědla jsou reprezentovány spojtým médem charakterzovaným delektrckou konstantou ε. Molekula je umístěna do sfércké dutny o zvoleném poloměru a (obr. 3.3). Dpólový moment 39

40 molekuly ndukuje dpólový moment v kontnuu a jeho elektrcké pole pak zpětně nteraguje s molekulou. Elektrostatcký efekt rozpouštědla je reprezentován poruchovým členem, který přčteme k Hamltonánu molekuly ve vakuu H. Celkový Hamltonán potom bude mít tvar Hˆ = Hˆ ˆ Eˆ µ R (3.56) kde µˆ je operátor dpólového momentu molekuly a Ê R je reakční pole dutny v delektrku. Obr. 3.3: Onsagerův model rozpouštědla se sférckou dutnou. Základním omezením Onsagerova modelu je, že pro molekuly s nulovým dpólovým momentem je poruchový člen nulový a nepopsuje tedy žádnou nterakc s rozpouštědlem, navíc nezohledňuje obecně složtý tvar molekuly. COSMO model Základní myšlenkou kontnuálního COSMO modelu (conductor lke contnuum solvent 3, 4 model) je, že vlastnost rozpouštědla se podobají vlastnostem dokonalého vodče. Praktcky je vlv rozpouštědla je smulován pomocí stínících nábojů ndukovaných na ploškách konečné velkost okolo molekuly tvořících hranc kontnua. Tento stínící náboj je třeba počítat numercky a teratvně tak, že se vhodně zvolený povrch dutny rozdělí na velký počet malých plošek (segmentů). Poté se spočte náboj ndukovaný na těchto segmentech a v celkovém Hamltonánu systému pak vystupují ještě členy zahrnující nterakc segmentsegment a molekula-segment. 5 V programu Gaussan 3 8 se dutna vytváří zpravdla tak, že se kolem každého těžkého atomu vytvoří koule (vodíkové atomy jsou umístěny dovntř sféry náležející atomu, ke kterému jsou navázány, přčemž poloměr sféry se odpovídajícím způsobem zvětší). Povrch koule je pak rozdělen na trojúhelníkové segmenty, jejchž počet (stejně jako počet a poloměr koulí) je pro dané rozpouštědlo optmalzován, ale v případě nutnost je ho možno změnt. 4

41 Obr. 3.4: Dutna u COSMO modelu vytvořená kolem molekuly obojetného ontu L-prolnu. Podrobný pops konstrukce povrchu dutny je popsán v lteratuře 6. Je známo, že COSMO dobře popsuje solvatační energe molekul. 7 Oprot Onsagerovu modelu má navíc tu výhodu, že tvar dutny odráží skutečný tvar molekuly. Elektrcká permtvta rozpouštědla a velkost dutny zde vystupují jako parametry. Relatvní jednoduchost modelu nám navíc dovoluje spočítat energe a gradenty analytcky dostatečně přesně a bez enormního nárustu výpočetního času čase. Na mnoha studovaných systémech, 44, 8 včetně systémů prezentovaných v této prác, se potvrzuje, že pro kvaltatvně přesné smulace je nutno efekt hydratace zahrnout do výpočtů bomolekul ve vodném prostředí. 3.7 Optmalzace geometre Optmalzace geometre molekuly byla od počátku v centru pozornost kvantové cheme. Nejvíce se osvědčly metody založené na kvadratcké aproxmac povrchu potencální energe, 9 ale exstují jné přístupy. U kvadratckých metod je Hessán (matce druhých dervací energe (3.)) odhadnuta pro každý optmalzační krok nebo je aktualzována v průběhu optmalzace. Druhý postup je preferován, neboť výpočet gradentu je u ab nto metod mnohem méně náročný než výpočet Hessánu. Za všechny metody uveďme aktualzac gradentu pomocí Broyden-Fletcher-Goldfarb-Shannova (BFGS) algortmu. Výběr vhodného souřadného systému hraje prvořadou rol v optmalzac molekulárních struktur. Gradent energe a Hessán jsou v kvantově chemckých programech často počítány v kartézských souřadncích, které ovšem pro optmalzac geometre nejsou většnou přílš vhodné. Pulay ukázal, že pro systémy vázané kovalentním vazbam je nejlépe optmalzac, 3 provádět v redundantních vntřních souřadncích. 4

42 Na optmalzac využívající redundantní vntřní souřadnce je založena základní optmalzační procedura v programu Gaussan 3 8 využívající Bernyho algortmu. 4 Tuto procedura umožňuje také vyhledávání přechodových stavů (sedlových bodů) mez zadaným lokálním mnmy. Toto bylo použto př prozkoumávání konformačního prostoru L-prolnu kaptola 5.3. Bernyho algortmus je možno použít také s vntřním souřadncem. 5 Redundantní vntřní souřadnce však nejsou v některých případech (zvláště pro slabě vázané skupny molekuly) přílš vhodnou volbou, neboť optmalzace konverguje velm špatně. To je způsobeno numerckým nestabltam způsobeným velkým počtem násobení matc přechodu mez kartézským a redundantním souřadncem. Optmalzace geometre podle normálních vbračních módů je jž osvědčenou technkou, pomocí které je možno se zmňovaným problémům vyhnout a navíc lze přímo kontrolovat vbrační pohyb. Ukazuje se, že je numercky stablnější než optmalzace v redundantních vntřních souřadncích, zvláště pro flexblní a slabě vázané (vodíkovým vazbam) systémy. Základní metoda byla dále rozšířena o možnost fxovat různé geometrcké parametry jako vzdálenost, úhly nebo torzní úhly, navíc také umožňuje optmalzovat geometr tak, aby polohy jader byly udržovány na konstantním elektrostatckém potencálu. 6 Optmalzace pomocí normálních vbračních módů Procedura je založena na obvyklé kvadratcké aproxmac. Je třeba vypočítat gradent podle normálního vbračního módu () g, druhou dervac energe (Hessán), normální vbrační módy () Q v kroku. Optmalzační krok směrem k energetckému mnmu je dán Newton- Raphsonovým vztahem modfkovaným metodou obecné raconální optmalzace funkcí (ratonal functon optmzaton RFO). 7, 8 Optmalzační proceduru pomocí normálních vbračních souřadnc je možno rozdělt do několka kroků:. Počáteční odhad Hessánu. Výpočet gradentu () f a z něj výpočet S matce (defnce vz. vztah 3.). () gc podle kartézských souřadnc. 3. Je-l dostupný předchozí krok, provede se aktualzace Hessánu f pomocí BFGS ( ) ( + ) ( ) ( g T ( ) ) g ( ) ( ) ( f dx ) algortmu T ( ) ( ) dx f f = f + (3.57) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) dx g dx f dx 4

43 kde dx = x x ( ) ( ) ( ) je rozdíl v kartézských souřadncích a v gradentech. Vypočte se nová S matce. 4. Vypočte se gradent v normálních módech g ( ) T ( ) C g = g g ( ) ( ) ( ) C C je rozdíl = S g (3.58) a pokud je menší než zadané krtérum, struktura se považuje za optmalzovanou. 5. Vypočte se nový krok a využtím kvadratcké závslost a RFO (vz dříve) dq ( + ) = Q + g Q ( ) + 4( g ( ) ). (3.59) 6. Vypočtou se nové kartézské souřadnce 7. Zvýší se o a přejde se ke kroku. ( + ) ( ) ( + ) x = x S dq. (5.6) Optmalzace v normálních módech je mplementována v programu QGRAD,, 6 jehož vstupem jsou energe, gradenty a druhé dervace z výstupu ab nto výpočtu (pomocí programu Gaussan 3, s kterým je QGRAD propojen) a vypočte změněné souřadnce. QGRAD také zajšťuje výpočet normálních vbračních souřadnc (dagonalzací slového pole) a transformac souřadnc. Na závěr poznamenejme, že neexstuje unverzální optmalzační metoda vhodná pro všechny molekulární systémy. Pro většnu obvyklých systémů je optmalzace v redundantních vntřních souřadncích nejvýhodnější (z hledska rychlost výpočtu a pohodlnost př zadávání). Pro smulace vbračních spekter hraje optmalzace geometre v normálních módech nezastuptelnou rol. 3.8 Přenos tenzorů molekulárních vlastností Stejně tak jako výpočet slových polí (FF, Hessán), tak výpočet tenzorů popsujících vlastnost molekul (např. dervace tenzorů polarzovatelnost a optcké aktvty) pomocí ab nto metod je lmtován velkostí molekul a výkonem počítačů. I přes to, že výpočetní možnost jsou neustále posouvány kupředu, výpočet realstckých slových polí bologckých molekulárních systémů na ab nto úrovn zůstává stále hlavním problémem. 43

44 Jednou z možností, jak zmňovaný problém obejít, je rozdělt studovaný systém na několk částí, pro ně spočítat hledané tenzory, a ty pak přenést na cílovou molekulu. Ukazuje se, že tento přenos je výhodné provádět v kartézských souřadncích 9. Výpočet slového pole velké molekuly je založen na chemcké topologcké podobnost mez částí F velké molekuly XXXFXXX a částí f malé molekuly xfx. Přenos tenzoru slového pole lze rozdělt do několka kroků. Nalezení kartézských souřadnc velké molekuly. Může být použta struktura z PDB databáze apod. nebo je velká molekula navržena podle požadovaných krtérí (v tomto případě je spektrální analýza jedním z testů správnost navrženého modelu).. Vypočte se slové pole malých fragmentů (molekul) na ab nto úrovn. 3. Klíčový krok představuje nalezení správného překryvu mez fragmenty f a F pro každý pár atomů λ a µ, které jsou částí daného fragmentu. Nejdříve se vyberou dvě dentcké odpovídající soustavy m atomů ve fragmentech f a F, které obsahují nebo jsou spojeny s atomy λ a µ. Poté je orentace část f z molekuly xfx hledána tak, aby byl maxmalzován překryv s fragmentem F v molekule XXXFXXX. To se provádí mnmalzací výrazu daného metodou nejmenších čtverů m ( U ) = ( r ( F) U r ( f )) = δ, (3.6) kde r (F) a r ( f ) označují souřadnce atomů ve fragmentech f a F vzhledem k jejch geometrckým středům T a T'. Pokud jsou geometre f a F dentcké, rotace souřadného systému postačuje k provedení přenosu slového pro tento fragment v jedném kroku. 4. Untární transformace U je dána Eulerovým úhly rotace a pomocí ní je možno pomocí lneární transformace spočítat přenos kartézských slových konstant z f na F pro pár atomů λ a µ: E λ r r α µ β E ( F) = Uαγ U βδ ( f ) λ µ r r γ δ (3.6) Obsahuje-l malá molekula několk fragmentů f, slové konstanty získané přenosem z každého z nch mohou být průměrovány nebo váženy podle vzdálenost atomů λ a µ od fragmentu f apod. Například pro velkou molekulu XXXFXXXX a malou xfxf'xf''x, kde f = f' = f'' = F, je možno provést tř překryvy a nepřesnější slové pole může být získáno průměrem ze všech tří přenosů. 44

45 Některé dlouhodosahové nterakce nemusí být přenosem tenzorů dobře posthnuty. Př vhodně zvoleném postupu jsou však tyto nterakce zanedbatelné a je možno je zanedbat. Druhou možností je spočítat velkou molekulu na nžší úrovn teore. Dervace tenzorů polarzovatelnost a optcké aktvty je možno přenést pomocí matce U podobně jako u slových konstant. U G' a A tenzorů je však třeba dát pozor na to, že jsou závslé na počátku souřadnc, a používat lokální systém souřadnc (dstrbuted orgn gauge), kde jsou dervace vyjádřeny v systémech s počátky na pohybujících se atomech A λ A α, βγ ( ) α, βγ = λ λ xε xε αβ λ xε α ( λ) α () = x x αβ λ ε αβ λ xε αβ λ ε G ( λ) G () ω λ α () = + ε βγδ Rγ () 3 R λ β α αγ λ xε () + R λ γ α αβ λ xε αδ λ xε () + R λ δ α () δ αδ λ xε βγ (3.63) (3.64) (3.65) Metodu přenosu tenzorů je možno použít také na přenos tenzorů vyšších dervací (např. pro anharmoncké korekce apod.). 3.9 Použtí molekulární dynamky př studu reálných systémů. Molekulární dynamka (MD) se ukazuje být v mnoha případech velce užtečným nástrojem př modelování reálných systémů. Je možné j použít na velké systémy čítající tsíce atomů s explctním zahrnutím molekul rozpouštědla. Přehledné základy teore molekulové dynamky 3, 3 je možno nalézt v mnoha bografích, za všechny uveďme alespoň dvě. Molekulárně dynamcké smulace spočívají v numerckém řešení klasckých pohybových rovnc, které je možno napsat jako m & r = F (3.66) kde sílu F působící na částc je možno vypočítat z potencální energe systému U F = r, r, r ( K, r N ) (3.67) Uvedené rovnce představují pro N částc soustavu 3N rovnc. Potencální energ je možno rozdělt na nterakce mez nevázaným atomy a atomy spojeným chemckým vazbam. První část potencální energe je možno rozdělt na jednočástcové, dvoučástcové, tříčástcové a další výrazy 45

46 U non bonded = u( ) + v( r, r j ) + j> r L (3.68) kde jednočástcový potencál u( r ) může reprezentovat vlv vnějšího pole na systém nebo efekt působení stěn systému apod. Dále je obvyklé zanedbávat tříčástcové a vyšší členy a párový potencál vyjádřt ve tvaru v r, r ) = v( r ) (3.69) ( j j Pro systémy tekutn se velm osvědčl Lenard-Jonesův potencál obsahující v sobě přtažlvý repulzní člen v LJ 6 σ σ ( r) = 4ε (3.7) r r s dvěma emprckým parametry: σ určuje šířku a ε hloubku potencálu. Jsou-l v systému přítomny náboje (atomů), je nutno použít také odpovídající Coulombcký potencál qq ( r) = 4πε r (3.7) v C kde q a q jsou dané náboje a ε permtvta vakua. Potencál atomů spojených vazbam je možno rozdělt do několka výrazů U bonded = ( d d ) + k ( α α ) [ A cos( τ ) + A cos(τ ) + A3 cos(3τ )] + torzní úhly, k vazby, úhly, α + k oop oop, s (3.7) které popsují postupně vazbu mez atomy, vazebné úhly, torzní úhly a nakonec mmorovnné (oop out of plane) souřadnce. Uvedená rovnce obsahuje celou řadu emprckých parametrů, které je možno získat například na základě ab nto výpočtů. V mnulost byly publkovány stovky různých souborů těchto parametrů pro různé skupny molekul, zpravdla nazývaných "slová pole". Mez nejznámější patří Amber94, 3 Amber99, 33 Amber3, 34 Charmm7. 35 V nám prováděných smulacích byly použty programové balíky AMBER8 36 a TINKER. 37, 38 Pro smulac ve vodném prostředí exstuje opět celá řada slových polí pro vodu, nejznámější je as TIP3P, 39 který byl několkrát použt v této prác. V rámc řešení dsertační práce jsem provedl srovnání vlvu různých slových polí na tvar plochu potencální energe pro molekulu L-alanyl-L-alannu. Výsledky byly porovnány jak s ab nto výpočty tak s NMR daty (chemcké posuvy a nepřímá spn-spnová nterakce). 4 Jednou z aplkací na něž byla molekulární dynamka použta je prohledávání konformačního prostoru velkých molekul, u nchž není možné kvůl velkost systému použít ab nto metody. V deálním případě je možno tyto výsledky přímo srovnat s expermentálním 46

47 daty, což je ukázáno v kaptole 5.4, která se týká určováním konformace hnge peptdu a jeho analogů. Výslednou geometr získanou pomocí MD smulací lze také použít pro přenos tenzorů molekulárních vlastností z menších fragmentů získaných na ab nto úrovn. Příkladem tohoto přístupu je naše práce, 4 která vznkla v průběhu ročního pobytu na Unversty of Illnos at Chcago. Mým příspěvkem bylo provedení smulací homo-tetrapeptdu (H-[(S)-Bn] 4 -OMe) se složtým postranním řetězcem. Nejprve byl pomocí MD smulací prohledán konformační prostor celé molekuly a na vybrané konfgurace byly přeneseny tenzory spočtené pro kostru molekuly a postranní řetězce. Srovnáním s expermentálním VCD spektry bylo ukázáno, že převládající konformací molekuly rozpuštěné v CDCl 3 je 3 -helx. MD smulace je také možno využívat na zkoumání dynamckých vlastností molekul rozpouštědla v okolí rozpuštěné látky. Z atomových konfgurací zaznamenávaných v daných časových ntervalech je např. možné vhodně vybrat nejblžší solvatační vrstvy kolem molekuly a ty pak použít jako počáteční geometr pro ab nto smulace. Tento přístup byl využt např. u studa amnokyselny L-prolnu, jak je uvedeno v kaptole 5.. Kombnovaný MD a ab nto přístup je možno ještě rozšířt a využít elektrcký potencál tvořený molekulam rozpouštědla v okolí studované molekuly. Ten jsme použl pro emprcké korekce vbračních frekvencí a ntenzt. Např. u molekuly N-methylacetamdu se tímto přístupem podařlo dosáhnout realstckého tvaru absorpčních pásů v oblastech frekvencí odpovídajících vbracím amdu I, II a III. 4 47

48 4. Expermentální uspořádání, metodka měření a zpracování ROA spekter 4. Pops ROA spektrometru Aparatura vybudovaná na Fyzkálním ústavu UK je založena na modulac polarzace budícího záření (ICP) v geometr zpětného rozptylu. Př její konstrukc byla použta stratege skupny Laurence D. Barrona. 5 Obr. 4.: Optcké schéma spektrometru pro měření Ramanovy optcké aktvty. Optcké schéma spektrometru je znázorněno na obr. 4.. Zdrojem záření je kontnuální argonový ontový laser (Coherent Innova 35). Interferenční fltr nebylo třeba nstalovat, neboť plazmové záření laserové trubce nebylo v měřených spektrech pozorovatelné. Za výstupem laseru je umístěn Glan-Taylorův polarzátor (GT, Leysop) zvyšující stupeň lneární polarzace budícího záření. Svazek lneárně polarzovaného záření vstupuje do elektrooptckého modulátoru (EOM) (Leysop EM 565), který generuje pravo- a levotočvě kruhově polarzované záření. EOM je podélná Pockelsova cela, jejímž základem je krystal ddeuterofosforečnanu draselného (KD*P). Aby se zabránlo dvojlomným posuvům v důsledku teplotních změn, je krystal umístěn v teplotně stablzovaném pouzdře, jehož teplota je stablzována pomocí kontrolní jednotky (CAL 3) na 8 C s přesností ±, C. 48

49 Modulovaný paprsek je fokusován do vzorku plosko-vypuklou křemennou čočkou (Melles Grot LQP3, f=5 mm, průměr 5 mm). Díky tomu, že aparatura využívá uspořádání zpětného rozptylu, bylo nutno mez fokusující čočku a vzorek umístt vrtané prvky: 45 -zrcadlo, kolmující čočku a Lyotův depolarzátor. Budící svazek prochází otvory o průměru,5 mm vyvrtaným ve středu těchto optckých prvků a vstupuje do kyvety se vzorkem. Pro měření se nejlépe osvědčly křemenné fluorescenční kyvety 5 5 mm (Hellma.57, vnější rozměr 7,5 7,5 mm, Quartz SUPRASIL), které jsou umístěny v kombnovaném mechanckém držáku (Melles Grot, Vývojové dílny MFF UK) umožňujícím posuv ve směru os x, y a z. Mnmální potřebný objem vzorku je přblžně 9 µm, pro objemy µm a více je měření velm pohodlné. Rozptýlené záření je sbíráno pod úhlem 8 vzhledem ke směru šíření budícího záření a následně depolarzováno Lyotovým depolarzátorem (Leysop), který zamezuje vznku polarzačních artefaktů př odrazu na 45 zrcadle. Sestává ze dvou destček z krystalu kalctu o tloušťkách 3,5 a 7 mm, které jsou slepeny optckým cementem a jejchž optcké osy jsou vůč sobě otočeny o úhel 45, ±,. Velm důležté je, aby byla slnější část Lyotova depolarzátoru otočena směrem ke vzorku, což zajšťuje lepší depolarzac záření a tedy nžší úroveň artefaktů (tento fakt byl expermentálně ověřen, jev je velm výrazný pro oblast vbrací s nízkým vlnočtem). Depolarzátor je umístěn společně s kolmující dvojvypuklou křemennou čočkou (f = 5 mm, průměr 5 mm, zacloněna na cca f/,, Optcká a sklářská dílna MFF UK) v držáku s mkrometrckým posuvy x a y, a navíc je vložen do mkrometrckého otočného držáku (Melles-Grot), který umožňuje jeho samostatnou rotac kolem osy z. Všechny zmňované optcké elementy jsou ze vstupní výstupní strany pokryty antreflexní vrstvou. Depolarzovaný a kolmovaný svazek je rovnným zrcadlem elptckého tvaru o rozměrech 3 4 mm (Optcká sklářská dílna MFF UK) svírajícím s dopadajícím paprskem úhel 45 odkloněn o 9 od původního směru (do směru osy -y). Povrch zrcadla je pokryt stříbrem s ochrannou vrstvou SO (Vývojová optcká dílna AV ČR), které má vyšší odrazvost (až 93%) než vrstva hlníková a dále pak menší rozdíl v odrazvost pro s a p polarzac dopadajícího záření. Zrcadlo je umístěno na specálním držáku umožňujícím jeho jemné naklápění kolem horzontální a vertkální osy (Vývojové dílny MFF UK) a dále na x, y, z posuvech (Melles Grot) dovolujících jeho přesné polohování. K potlačení Rayleghova rozptylu je do kolmovaného svazku umístěn holografcký SuperNotch-Plus fltr o průměru " (Kaser Optcal Systems, Inc., 54,5 nm, optcká hustota >6., spektrální hrana < 5 cm - ). Před "notch" fltr je vhodné vložt do osy svazku 49

50 nepropustný kruhový terčík o průměru cca mm, který odstraňuje "málo depolarzované" záření, tj. záření v blízkost středu svazku, jež prošlo depolarzátorem pod malým úhlem. Lyotův depolarzátor totž pracuje nejefektvněj v slně rozbíhavých svazcích. Dojde tak sce ke ztrátě přblžně -3% sgnálu, která je ale bohatě kompenzován zvýšením kvalty spekter díky potlačení artefaktů. Prošlé záření je fokusováno světelným fotografckým objektvem AF Nkkor 5 mm f/.4d (Nkon) na vstupní štěrbnu spektrografu. Mez objektvem a štěrbnou je ještě umístěna elektroncká závěrka ovládaná přímo z kontrolní jednotky CCD detektoru. K dosažení co nejlepšího poměru sgnál/šum je použt vysoce světelný stgmatcký jednomřížkový (sngle-stage) spektrograf (Kaser Optcal Systems, model HoloSpec f/.4) v osovém (n-axs) uspořádání. Šířka vstupní štěrbny není nastavtelná, ale štěrbnu je možno vyměňovat. Pro většnu expermentů byla použta štěrbna o šířce 5 µm, která poskytuje př budícím záření 54,5 nm spektrální rozlšení přblžně 6,5 cm - (k dspozc je také štěrbna 83 µm/ cm - ). Výška štěrbny je vždy 8 mm. Uvntř spektrografu je záření kolmováno fotografckým objektvem Nkkor 85 mm f/.4 (Nkon), dfraktováno holografckou transmsní mřížkou (HSG-54.5-LF) a nakonec fokusováno objektvem Nkkor 85 mm f/.4 na zpětně osvětlovaný (back-llumnated) CCD detektor (LN-CCD-34/-EB/, Roper Scentfc) s kvantovou účnností v používané spektrální oblast až 8%. CCD čp je umístěn do fokální rovny výstupního objektvu, která má šířku 5 mm. Vstupní matce kapalným dusíkem chlazeného detektoru obsahuje 34 detekčních elementů (pxelů) na ploše 6,8, mm. Velkost jednoho pxelu je tedy µm. Posuvný regstr detektoru je umístěn podél delší osy detektoru. Kontrolní jednotka ST-33 je opatřena 6-t btovým A/D převodníkem s výrobcem garantovanou lneartou > 98%. Kapalný dusík vydrží v dobře vyčerpané Dewarově nádobě u detektoru až 4 hodn. Čerpání nádoby je třeba provádět alespoň jednou za rok. Pracovní teplota detektoru byla nastavena na - C. Klíčovým elementem aparatury je vysoce světelný spektrograf s novou transmsní mřížkou založenou na "volume-phase" technolog. 43 Mez kolmačním a fokusačním objektvem prochází kolmovaný svazek záření, které je transmsní mřížkou o účnnost pro nepolarzované záření až 8% 44 odkloněno o 9. V kombnac s dobře korgovanou optkou použtých fotografckých objektvů je možno dosáhnout rovnného zobrazení (stgmatcký spektrograf) až na úrovn dfrakční lmty. Použtá mřížka má dsperz.6 cm - /pxel (3. nm/mm) a na CCD detektoru je tak možno zaznamenat oblast od cca - do 4 cm - (př exctac 54,5 nm). 5

51 Další provedené úpravy spektrografu Před dokončením dsertační práce byla na ROA spektrometru provedeno ještě několk úprav, které bude v budoucnu ještě třeba dostatečně otestovat. Všechna měření uvedená v této prác byla provedena ještě bez následujících vylepšení. Za EOM byla umístěna rotující půlvlnová destčka (Zero Order Crystallne Quartz Retardaton Plate, Standa, model WPZO.-@53) umožňující v průběhu expermentu vystředovat zbytkovou elptctu záření vycházejícího z EOM. 35 Půlvlnová destčka je usazena v rotující motorzovaná jednotce (Standa, model 8MR5-3) řízené z PC. Rychlost otáčení je možno volt, optmální je např. /s. Je třeba s ještě uvědomt, že umístěním tohoto prvku do optcké dráhy dojde ke změně smyslu kruhové polarzace záření dopadajícího na vzorek, to znamená, že př výpočtu rozdílu akumulací dvou sgnálů je třeba zaměnt menšence a menštele. Jedním z omezení př použtí ROA jsou poměrně velké nároky na množství vzorku. Jednou z cest k odstranění tohoto problému je redukce objemu vzorku. Byl vyroben držák na specální kyvety (Starna, /SHORT/4X4/B/AR, ztenčené stěny, antreflexní pokrytí MgF ) o vntřním rozměru 4 4 mm, které umožňují zmenšt objem vzorku až na 6µm, dále byly poměrně úspěšně testovány také kyvety 3 3 mm (Hellma,.5-QS) s použtelným objemem 3 µm, u nchž už ale dochází ke značné ztrátě sgnálu (3%) a začíná se projevovat výrazný sgnál skla (tato kyveta nemá ztenčené stěny). Velké rozšíření možností ROA spektrometru představuje měření vzorků za různých dobře defnovaných teplot. Byla navržena a vyrobena teplotní cela (mechancká dílna FÚ UK), přpojená k crkulačnímu termostatu Neslab RTE, dovolující měření př teplotách vzorku v rozmezí od cca 5 do 9 C. Teplotní cela byla navržena tak, aby do ní bylo možné umístt různé typy kyvet. Exctační Ar + laser byl nahrazen laserovým systémem Verd (Coherent), dodam čerpaný Nd:YAG laser s generací druhé harmoncké s vlnovou délkou 53 nm a maxmální výstupní výkonem W, což sce přneslo nákladnou výměnu SuperNotch Plus fltru a holografcké mřížky spektrografu (za HSG-53-LF, pokrytí - až 35 cm -, dsperze,4 cm - /pxel (3, nm/mm), Kaser Optcal Systems, Inc.), na druhou stranu však znamená výrazně nžší náklady na provoz a údržbu exctačního laseru a snížení hladny hluku v laboratoř. Řídící část ROA spektrometru Blokové schéma spektrometru je znázorněno na obr. 4.. Experment je řízen pomocí PC (Pentum II/4 MHz, 8MB RAM), kterým je ovládáno spínání napětí přváděného na 5

52 elektrooptcký modulátor pro generování pravo- a levotočvě kruhově polarzovaného budícího záření a sběr dat z CCD detekčního systému. Napětí přváděné na EOM je zesílené výstupní napětí stablzovaného nízkonapěťového zdroje (NNZ). Zesílení je dosaženo dferencálním zeslovačem (Leysop, model 5) s maxmálním vstupním napětím ±,5 V. NNZ je řízen dvěma TTL sgnály generovaným paralelním PIO nterfacem řídícího počítače, jedním pro kladné a druhým pro záporné vstupní napětí. Úroveň stablzovaného výstupního napětí je možné měnt pomocí přesného potencometru v rozmezí,5 V s ctlvostí,5 mv. Obr. 4.: Blokové schéma ROA spektrometru. Červeně jsou označeny prvky, které byly do aparatury zabudovány, ale je třeba je otestovat. Čárkovaně jsou naznačena elektroncká spojení, která nejsou sce pro chod expermentu bezpodmínečně nutná, ale mohou být použta pro automatzac. CCD detektor je ovládán pomocí kontrolní jednotky ST33 (Prnceton Instruments). Základem řídícího softwaru je programový balík Wnspec/3 (verze.5.4.4) a knhovny Macro Record Opton, které umožňují ovládat Wnspec z prostředí programu Vsual Basc 6. V tomto jazyku bylo také vyvnuto prostředí pro ovládání, komunkac s jednotlvým prvky aparatury a ukládání dat. Podrobný pops a použtí programového prostředí je uveden v kaptole 4... Přes USB je a napojen a ovládán krokový motor zajšťující rotac půlvlnové destčky umístěné za EOM (Standa, 8SMC-USBh - Mcrostep Drver (USB Interface)). Stávající řízení spektrometru bude možno v budoucnu ještě doplnt a umožnt tak např. automatckou ochranu vzorku před znčením apod. Jde především o napojení měrky výkonu (FeldMax-TO, Coherent, part number 58846, hlava OP- VIS part number 633 s atenuátorem : part number s velm rychlou odezvou cca ms) přes 5

53 USB a zaznamenávání výkonu procházejícího záření za vzorkem v průběhu měření. To by umožnlo př dlouhodobých měřeních (bez přítomnost obsluhy) kontrolu, zda nedochází ke změnám (agregac, rozptylu) ve vzorku. Kontrolní jednotka laseru může být také napojena na řídící PC přes RS 3 a v případě potřeby by laser mohl být vypnut (přepnutím do režmu STANDBY), čímž by bylo možné zabránt znčení drahého nebo nenahradtelného vzorku. Přes RS 3 je také možné ovládat z PC teplotní lázeň. 4. ROA Experment 4.. Sestavování aparatury Stavba a ladění aparatury je náročný proces, př dodržení správného pořadí kroků je však možné ho zvládnout bez větších potíží během několka dní. Aparatura je umístěna na alumnové desce 6 9 cm se sítí otvorů 5 5 mm (Melles Grot), která umožňuje snadnou a reprodukovatelnou montáž. Držáky jsou přpevňovány přímo k desce, vůle před utažením šroubů dovoluje dostatečné naklápění k nastavení kolmost optckých elementů na osu procházejícího svazku. Nastavení aparatury je možno rozdělt do několka kroků: I. Defnování optckých os. Nastavení polohy laseru. Provádí se pomocí nastavovacích clonek (jedna na začátku, druhá na konc stolu, případně jedna hned za výstupem z laseru), případně podle značky na zd.. Nastavení polohy spektrografu. Není-l to už provedeno, je třeba dobře defnovat optckou dráhu záření vstupujícího do spektrografu. Na základní desku se umístí pomocné kolejnce a clony, kolmo na budící svazek se nastaví svazek vycházející z pomocného He-Ne laseru (svazek musí být vodorovný). Podle nastaveného svazku pomocného laseru se najde správná poloha spektrografu: ze spektrografu se vyjme mřížka, místo ní se vloží nastavovací kolík, podle procházejícího svazku se nastaví správná výška a orentace spektrografu. II. Sestavení optcké část systému a maxmalzace Ramanova sgnálu 3. Nastavení polohy EOM. Provede se pomocí posuvů podél os x a y tak, aby svazek procházel středem krystalu uvntř EOM. Orentace krystalu (rotace kolem os x a y) se nastavuje podle 53

54 reflexí na cloně za výstupem laseru (clona, obr. 4.4). Rotace kolem osy z se provede jen orentačně, přesněj bude nastavena pozděj. Obr. 4.3: Optcká část aparatury a poloha clon (označeny červeně a očíslovány) používaných pro nastavování aparatury. 4. Nastavení kolmost polarzátoru na vstupní svazek. Polarzátor se umístí před EOM kolmo na procházející svazek záření. Jeho orentac je třeba nastavt tak, aby střed kruhu tvořeném stopou od zpětné reflexe př rotac polarzátoru na cloně souhlasl se středem clony. Vzdálenost zpětných reflexí od středu clony by neměla překročt cca - mm. 5. Nastavení orentace polarzátoru. Měrka výkonu se umístí za EOM, rotací polarzátoru kolem osy z se nastaví pro maxmální hodnotu výkonu procházejícího záření. Obr. 4.4: Poloha zpětných odrazů z EOM na cloně (plné body) a polarzátoru (prázdné body) v deálním případě. Př rotac polarzátoru ( EOM) kolem osy z by měly zpětné reflexe rotovat kolem středu clony. 6. Nastavení polohy Lyotova depolarzátoru kolmo na rovnu svazku (fokusační čočka ještě není v držáku přpevněna!). Pokud by nebyl depolarzátor nastaven kolmo na procházející svazek, docházelo by př jeho rotac k odklánění rozptýleného svazku a k pohybu zobrazované stopy v rovně štěrbny spektrografu. Následkem toho by docházelo k velkým změnám 54

55 ntenzty detekovaného Ramanova záření a správnou polohu depolarzátoru (rotace kolem osy z) př ladění ROA sgnálu by pak nebylo možno nalézt. Na počátku nastavování je nutno snížt výkon laseru, Lyotův depolarzátor se posune ve směru osy x nebo y tak, aby jím procházel laserový svazek (př měření tato stuace samozřejmě nenastává). Zpětná reflexe na cloně 3 (vz obr. 4.5) za EOM slouží jako velm dobrý ukazatel, zda je depolarzátor nastaven kolmo na procházející záření. Cílem je mnmalzovat průměr kruhu, po kterém se reflexe pohybují př rotac depolarzátoru a umístt jeho střed na střed clony. Toho lze dosáhnout podkládáním tenkých hlníkových plíšků pod některý ze tří šroubů na držáku depolarzátoru, případně naklopením nebo podložením celého držáku depolarzátoru a kolmační čočky. Obr. 4.5: Zpětné reflexe od Lyotova depolarzátoru na cloně 3. Cílem je mnmalzovat kruh, který opsují reflexe př otáčení depolarzátoru a nastavt střed kruhu na střed clony. Nakonec se x a y poloha Lyotova depolarzátoru nastaví opět tak, aby budící záření procházelo středem vyvrtaného otvoru. 7. Nastavení polohy fokusační čočky (f = 5 mm). Plochá strana čočky je orentována směrem ke vzorku (to zaručuje deální zobrazení, ve skutečnost ale orentace čočky nemá na celkový výsledek přílš velký vlv). Nastavuje se poloha (xy-posuv v držáku čočky), vertkální (naklopení celého držáku kolem svslé osy) a horzontální (podkládáním alumnovým plíšky) naklápění podle odrazů na cloně 3 a procházejícím záření v místě značky na zd. Všechny reflexe se musí jevt středově symetrcké. Nakonec je třeba zkontrolovat polohu clonky 4 přlepené přímo na držáku čočky, tak aby laserový svazek procházel jejím středem. 8. Vzorková část. Je třeba nastavl kolmost kyvety podle reflexe na cloně 3. Správnou polohu je možno nastavt podkládáním plíšků mez držák kyvety a redukc. Celý systém se pak umístí na vertkální posuv. Tento postup je shodný pro kyvety umístěné v teplotní cele. 55

56 Kyvety 5 5 mm nemají antreflexní pokrytí a tak docházelo u Ar + laseru k rezonanc se stablzační dodou laseru, což způsobovalo velké nestablty výstupního výkonu laseru. Tento problém bylo možno vyřešt tím, že se kyveta před měřením mírně naklopla (opět kontrola dle reflexe na cloně 3). Tento problém by u Nd:YAG laseru neměl nastávat. 9. Nastavení kolmační čočky (f = 5 mm). Čočka se vloží zpět do společného držáku s Lyotovým depolarzátorem. Je nutno snížt výkon laseru na cca mw. Do vzorkového prostoru se zasune testovací lepená kyveta s bílou dfuzní (papírovou) stěnou (zůstává tam u kroků a nastavovací procedury). Nastavuje se x a y poloha celého držáku kolmační čočky a depolarzátoru tak, že sledujeme umístění stop rozptýleného záření na clonách 3 a 4. Stopy musí být symetrcké, stejně tak jako útvary tvořené př zavírání clony 4. Je-l kolmost Lyotova depolarzátoru dobře nastavena, stopa zpětné reflexe se př jeho rotac nepohybuje. To je umožněno také tím, že kolmační čočka je upevněna odděleně od depolarzátoru a př jeho rotac se neotáčí.. Nastavení 45 -zrcadla. Vyjme se notch fltr, objektv a závěrka. Vloží se clony 5 (těsně za zrcadlo) a 6 (těsně před spektrograf). Pomocí kolmovaného rozptýleného záření procházejícího clonam se nastaví poloha naklopení zrcadla. Př nastavování je třeba také kontrolovat, aby laserový svazek procházel středem otvoru v zrcadle (vyjme se papírová kyveta a zvýší se výkon laseru až na pracovní hodnotu, zkontroluje se průchod svazku středem otvoru v zrcadle posuvem ve směrech x a y, sníží se výkon laseru a vrátí zpět papírová kyveta pro doladění správného naklopení 9 -zrcadla). Nakonec se clony 5 a 6 odstraní.. Do pracovní polohy se vrátí závěrka a notch-fltr, jejch poloha se nastaví tak, aby kolmovaný svazek procházel jejch středem. Nakonec se do bajonetového držáku umístí fokusační objektv Nkkor 5/.4.. Ostření objektvu uvntř spektrografu, nastavení CCD do zobrazovací rovny spektrografu (naklopení CCD kolem horzontální a vertkální osy). Provádí se pomocí záření neonové výbojky (Orel, model 63 Neon). Na notch fltr se ze strany otočené k objektvu položí bílé papírové stínítko, které se rovnoměrně osvětlí neonovou výbojkou. Správné horzontální naklopení detektoru (pomocí šroubu HT na spektrografu) zajstí, aby byla současně v ohnsku levá pravá část detektoru. Obraz štěrbny je na detektoru zakřven a má tvar paraboly. 45 Pomocí vertkálního naklopení (šroubu VT na spektrografu) se zajstí, aby střed paraboly 56

57 souhlasl se středem detektoru. Správný sklon detektoru se nastaví v kroku 4. Zakřvení obrazu štěrbny je důležtý fakt, který je třeba př měření zohlednt. 3. Nastavení polohy objektvu a držáku vzorku. Oba tyty elementy je nutno nastavovat současně, neboť jejch poloha je vzájemně závslá. Do držáku vzorku se vloží kyveta o tloušťce 5 mm naplněná dostatečným množstvím toluenu. Nejdříve se nastaví poloha objektvu Nkkor 5mm tak, aby byla stopa strávně zobrazována na štěrbnu (z-posuv pro posun kolmo na štěrbnu a x-posuv pro umístění středu stopy na střed štěrbny). Závslost sgnálu na z-posuvu vzorku a y-posuvu objektvu je vzájemně závslá a je třeba hledat optmum sgnálu v závslost na těchto dvou parametrech současně. V průběhu nastavení je třeba občas zkontrolovat, zda stopa prochází středem štěrbny (z-posuv objektvu) 4. Nastavení správného sklonu detektoru. Spektrum toluenu se zobrazí v obrazovém (mage) módu a zkontroluje se, zda stopa maxmálního sgnálu prochází středem detektoru (maxmální ntenzta pásu ve svslém směru na stejném y-pxelu (podél svslé osy) pro pásy na levé pravé straně detektoru). Mírným opatrným naklopením a podložením CCD je třeba provést korekce. 5. Nastavení z-polohy fokusační čočky 5 cm. Zkušenost ukazuje, že optmálního sgnálu je dosaženo v případě, že ohnsko leží několk mm před středem kyvety. Kroky. 5. je třeba provádět teratvně (pro jemnější doladění je opakovat ještě alespoň jednou). 6. Před notch fltr se vloží kruhový terčík o průměru mm. Nastaví se do středu svazku (jeho správná poloha by měla odpovídat středu notch fltru). Dále je dobré ještě jemněj nastavt polohu vzorku a objektvu pro optmální sgnál (krok 3). Tento terčík blokuje málo depolarzované záření ve středu svazku (Lyotův depolarzátor pracuje nejlépe v slně dvergentním svazku, paprsky procházející blízko středu optcké dráhy jsou depolarzovány nejméně a př odrazu na 45 -zrcadlem mohou způsobovat největší artefakty). Kontrola čstoty optckých prvků Ukazuje se, že na optckých elementech, kterým prochází ntenzvní svazek laserového záření, dochází ve zvýšené míře k zachytávání mkroskopckých prachových částc a následkem toho v lepším případě ke ztrátě výkonu záření ve vzorku, v horším případě ke ztrátě kvalty záření (polarzačním artefaktům). Je tedy vhodné alespoň jednou za dva měsíce zkontrolovat hodnoty 57

58 ztrát výkonu procházejícího záření a pokud se tyto hodnoty výrazně zhorší oprot údajům uvedeným v tabulce 4., je nutno prvky standardní procedurou vyčstt. Například ztráta na fokusační čočce se za dva měsíce provozu zvýšla až o 3%, na elektrooptckém modulátoru čnla tato ztráta po několkaletém používání až 35%! Tab. 4.: Hodnoty útlumu procházejícího záření na jednotlvých elementech. Optcký prvek ztráta výkonu (% dopadajícího záření) polarzátor EOM 6 fokusační čočka (f=5 mm) 8 III. Generace kruhově polarzovaného záření nastavení elektrooptckého modulátoru Jedním z hlavních faktorů ovlvňujících úspěšné měření ROA spekter je generace co nejlepší kruhové polarzace budícího záření, která je zajšťována elektrooptckým modulátorem. Elektrooptcký modulátor použtý v ROA aparatuře je založen na Pockelsově jevu, který je lneárním elektrooptckým jevem. Elektrcké napětí přložené rovnoběžně se směrem procházejícího záření ndukuje v krystalu modulátoru dvojosou anzotrop (v nepřítomnost elektrckého pole je krystal jednoosý). Pro elektromagnetcké záření procházející jednoosým krystaly ve směru optcké osy exstuje pouze jedna hodnota ndexu lomu. Průmět ndexového elpsodu popsujícího rozložení ndexu lomu krystalu má v rovně kolmé k procházejícímu svazku tvar kružnce, je tedy stejný pro všechny orentace polarzačních rovn. Přložením napětí na krystal modulátoru ve směru rovnoběžném s procházejícím paprskem se z rotačního elpsodu stane elpsod trojosý, což znamená, že kolmý průmět elpsodu má nyní tvar elpsy s poloosam a a b (a b), vz obr Velkost poloos a a b je nepřímo úměrná ndexům lomu n a n e určujícím rychlost šíření paprsků s danou orentací polarzační rovny. Podle teore šíření elektromagnetckého záření může anzotropním krystalem procházet pouze záření lneárně polarzované ve směru jedné ze dvou poloos kolmého průřezu elpsodu ndexu lomu 46. Paprsek procházející krystalem modulátoru je proto v daném případě složen ze dvou ortogonálních složek určených povoleným směry v anzotropním krystalu. Lneárně polarzované ortogonální složky procházejícího paprsku jsou navzájem zpožděny o fázový o fázový rozdíl δ : 58

59 πd δ = n n e (4.) λ kde d je délka krystalu a λ je vlnová délka procházejícího záření. Fázový rozdíl δ je tedy lneárně závslý na délce krystalu d a na ndukovaném rozdílu ndexů lomu. Př Pockelsově jevu je změna ndexu lomu anzotropního prostředí úměrná velkost přloženého napětí a její závslost pro nám použtý krystal má tvar 47 : 3 U nx = n ± nr63 (4.) d kde n x je ndex lomu v povoleném směru anzotropního stavu, n je ndex lomu v zotropním stavu, U je velkost podélně přloženého napětí a r 63 je elektrooptcký koefcent. Obr. 4.6: Elpsod ndexu lomu. Z rozdílu ndexů lomu dvou složek procházejícího paprsku plyne vztah pro fázový rozdíl 3 π nru 63 δ = (4.3) λ Fázový rozdíl je tedy přímo úměrný velkost přloženého napětí, velčny r 63, n a vlnová délka λ jsou pro daný experment konstantní. V případě nulového napětí přloženého na krystal vystupuje z EOM nemodulovaný lneárně polarzovaný svazek, zatímco v případě přloženého 59

60 nenulového napětí vystupuje z EOM obecně elptcky polarzované záření. Hodnota fázového rozdílu δ bude rovna π 4 pro tzv. čtvrtvlnové napění; v tom případě z EOM vystupuje v závslost na polartě přloženého napětí pravo- nebo levotočvě kruhově polarzovaný svazek záření. Je důležté s uvědomt, že procházející paprsek je součtem ortogonálních složek polarzovaných ve směrech n a n e. Výše uvedená úvaha o generac kruhové polarzace může tedy platt jen tehdy, mají-l tyto složky stejnou velkost. Praktcky to znamená, že kruhově polarzované záření lze generovat pouze v případě, že směry n a n e budou s polarzační rovnou vstupujícího lneárně polarzovaného záření svírat přesně úhel 45. Pockelsova cela použtá v naší aparatuře obsahuje krystal ddeuterofosforečnanu draselného (KD*P), který pro generování kruhově polarzovaného záření vyžaduje čtvrtvlnové napětí ~,5 kv. Podle fremní charakterstky by měla propustnost krystalu ve vdtelné oblast dosahovat přblžně 89%. Elektrooptcký modulátor je optcký prvek, jehož funkce je závslá na orentac vůč procházejícímu záření a je tedy nutné nalézt expermentálně jeho optmální orentac a příslušná elektrcká napětí, která jsou na něj přkládána, což ční celkem sedm stupňů volnost. Příčná poloha (x, y posuv) a úhel vůč dopadajícímu paprsku (naklápění kolem os x a y) je možno nastavt už př sestavování optckého systému (krok 3), zbývá tedy nastavt orentac vůč polarzační rovně dopadajícího paprsku (rotace kolem osy z) a dvě čtvrtvlnová napětí (pro oba smysly kruhové polarzace vystupujícího záření). Tyto tř stupně volnost jsou na sobě navzájem závslé a je třeba je nastavovat současně. Elektrooptcký modulátor je nutno nastavt tak, aby se po přložení čtvrtvlnového napětí lneární polarzace paprsku vstupujícího do modulátoru změnla na kruhovou polarzac. K popsu kvalty kruhové polarzace záření lze použít rezduální elptctu η, která je zavedena na obr Obr. 4.7: Charakterzace elptcké polarzace procházejícího paprsku. 6

61 Nastavení EOM se provádí v uspořádání uvedeném na obr. 4.8 s vyžtím procedury navrženém Demem. 48 Úprava spočívá v umístění EOM mez dva lneární polarzátory, přčemž analyzátor (polarzátor umístěný za EOM) je uchycen v držáku umožňujícím jeho otáčení kolem osy svazku. Paprsek vystupující z EOM dopadá po průchodu polarzátorem na měrku výkonu. Obr. 4.8: Uspořádání aparatury pro nastavení EOM. Sledujeme ntenztu I svazku dopadajícího na měrku výkonu v závslost na úhlu φ vzájemné orentace obou polarzátorů. Pokud je napětí na EOM nulové, vystupující záření je lneárně polarzované a závslost má tvar kde I je ntenzta záření dopadajícího na analyzátor př φ = I = I cos φ (4.4). Platí, že pokud se hodnota přloženého napětí blíží hodnotě čtvrtvlnového napětí a polarzace záření vystupujícího z EOM se blíží kruhové polarzac, závslost I(φ) je charakterzována přblížením mnm a maxm k hodnotě I / tak, že v případě deální kruhové polarzace je I ( ) I φ =. V průběhu nastavování sledujeme hodnotu rezduální elptcty určené vztahem mn η = arc tg I (4.5) I max Cílem je dosáhnout hodnoty η co nejblžší k Nastavení čtvrtvlnových napětí a správné orentace krystalu v EOM. Nastavení je nutno provádět v několka krocích: a. nastavení výstupního napětí nízkonapěťového zdroje b. nastavení správné orentace krystalu (rotace kolem osy z) c. jemné doladění napětí na vysokonapěťovém zeslovač 6

62 Díky tomu, že použtý krystal v EOM není zcela deální, čtvrtvlnová napětí generující pravo- a levotočvě kruhově polarzované záření mají v reálném případě různou absolutní hodnotu. Jejch nezávslé nastavení (př stejné absolutní hodnotě vstupního napětí) je možné pomocí kontrolních lmtů dferencálního zeslovače (POSITIVE LIMIT, NEGATIVE LIMIT). Ctlvost celého procesu umožňuje nastavt čtvrtvlnová napětí přkládaná na EOM s dostatečnou přesností ±,5 V. Kroky b. a c. (nastavení POSITIVE LIMIT NEGATIVE LIMIT) je třeba provádět v součnnost a teratvně, zaznamenávat dosažené hodnoty elptcty, údajů na zeslovač úhlu natočení EOM kolem podélné osy tak, aby bylo možné systematcké zlepšování parametrů nastavení aparatury. V případě velkých změn v natočení EOM kolem osy z je třeba ještě provést kontrolu podle bodu. Aparatura je velce stablní v řádu několka týdnů, občas je však vhodné zkontrolovat a případně jemně donastavt čtvrtvlnová napětí. Zkušenost ukazuje, že hodnota rezduální elptcty nutná pro měření ROA spekter s mnmální úrovní artefaktů by měla být lepší než 44 a to pro obě točvost. Ukazuje se, že běžně je možné dosáhnout hodnoty až 44,3. IV. Optmalzace ROA sgnálu ladění aparatury Poslední fází ladění aparatury je optmalzace ROA sgnálu. Tato procedura spočívá ve sledování závslost ROA sgnálu na orentac Lyotova depolarzátoru, jehož správnou orentac je nutno nalézt expermentálně. V mnulost byly pro testování užívány kapalné chrální látky (enantomery α-pnenu nebo trans-pnanu). V současnost to však není přílš vhodné, neboť tyto kapalny poskytují ntenzívní Ramanův rozptyl a expozční doba jednotlvých akumulací musí tedy být extrémně krátká (řádově, s), aby nedošlo k přesycení detektoru. Doba odečtu sgnálu z CCD detektoru je však relatvně dlouhá (v obrazovém módu až s, ve spektrálním módu ~ s) a měření je tak velm neefektvní. Druhým důvodem je, že optmální poloha Lyotova fltru se většnou mírně lší pro čsté organcké kapalny a vodné roztoky, které jsou většnou na aparatuře studovány. Velm dobře se osvědčlo použtí koncentrovaných roztoků ( M) obou enantomerů dalannu (L-alanyl-L-alannu a D-alanyl-D-alannu), u nchž je možné dosáhnout velm dobrého poměru sgnál šum už za cca - mnut (akumulační doba kolem.5 s př výkonu laseru na vzorku cca 5 mw). Spektrum obsahuje pásy jak slně polarzované (ρ ) tak depolarzované (ρ 3/4), pro které mohou být v ROA spektrech pozorovány slné polarzační artefakty. 6

63 Nejdříve je vhodné proměřt závslost ROA sgnálu na poloze Lyotova depolarzátoru v rozsahu 36 s krokem, vybrat nejlepší polohu, doladt z-polohu objektvu a pak proměřt závslost ROA sgnálu v okolí této polohy s krokem v rozsahu alespoň ±5. Tento proces je nejvíce časově náročný a zabere většnou jeden až dva dny. Dobrým ndkátorem kvalty spekter dalannu je oblast slně polarzovaného pásu ~88 cm -, dále pak dublet kolem ~39 cm -, správný tvar pásu v oblast vbrací amdu I a oblast nízkých vlnočtů (obr. 4.9). 8 Raman (I R + I L ) -9 4 (I R - I L ) L-Ala-L-Ala ROA ICP Wavenumber (cm - ) D-Ala-D-Ala Wavenumber (cm - ) Obr. 4.9: Ramanovo a ROA spektrum obou enantomerů alanyl-alannu. Koncentrace obou vzorků c= M, spektrální rozlšení 6,5 cm -, doba akumulace 6 hod, výkon na vzorku 434 mw. Pozadí spekter nebylo korgováno. 4.. Programové vybavení ROA spektrometru Pro záznam spekter Ramanovy optcké aktvty bylo nutné vyvnout řídící program, který ovládá přepínání napětí na elektrooptckém modulátoru, načítá spektra odpovídající oběma kruhovým polarzacím budícího záření, ukládá součtové (Ramanovo) a rozdílové (ROA) spektrum a zahrnuje co největší rozsah funkcí používaných př ladění aparatury vlastním měření ROA spekter. Jedním z důležtých cílů bylo také zabezpečt ukládání (a následné vyvolávání) všech vstupních parametrů a hodnot nastavení údajů o měřeném vzorku. Tyto údaje jsou ukládány ve formě textových souborů a ke každému provedenému expermentu je tak uložen jednoznačně dentfkovatelný a snadno čtelný záznam. 63

64 Program byl vyvnut v prostředí Vsual Basc 6. s použtím knhoven WnXOpton pro program WnSpec/3 ovládající CCD detektor. Program obsahuje grafcké rozhraní pro Wndows, pomocí něhož je možno zadávat veškeré expermentální parametry. Obr. 4.a: Záznam CIS a CID L-alanyl-L-alannu ve spektrálním módu. Obr. 4.b: Záznam ROA spektra L-alanyl-L-alannu v obrazovém módu. Oprot konvenčnímu záznamu ROA spekter v jednodmenzonální podobě (ntenzta oprot pořadovému číslu pxelu na dsperzní ose) umožňuje program také pracovat se spektry v obrazovém (mage) módu, kdy se pracuje s hodnotam ntenzt jednotlvých pxelů detektoru, tedy ve dvojdmenzonální podobě. Tento způsob záznamu spekter otevřel nové možnost pro odhalování a určování zdrojů artefaktů ve spektrech. Obrazový mód je také standardně používán př sestavování a ladění aparatury. 64

65 Tab. 4.: Stručný přehled funkcí programového vybavení ROA aparatury menu funkce pops Man Expermental Setup ROI (Regon of Interest) Optonal Základní parametry expermentu expozční doba, počet akumulací, počet framů a kořenové jméno souborů, do kterých budou spektra ukládána Specfkuje využívanou oblast detektoru (menší oblast znamená rychlejší odečet). Umožňuje softwarové seskupování jednotlvých pxelů do tzv. superpxelů, čímž se sce snžuje efektvní rozlšení, ale zlepšuje se poměr sgnál/šum Zadává se výkon laseru, dosažená elptcta budícího záření (tato funkce se využívá př ladění EOM), nastavení spektrografu, nformace o použté kyvetě a vzorku. Hardware Nastavení optckých elementů aparatury (polohy mkrometrckých posuvů apod.). Tools EOM Voltage Přepíná polartu napětí přkládaného na EOM Calbraton Calbrate Raman Focus ROA Focus Důležtý nástroj umožňující současné zobrazení měření ve spektrálním obrazovém módu. Používá se př nastavování aparatury a zjšťování optmální expozční doby před každým měřením. Jednoduchý záznam ROA spekter bez nutnost ukládání expermentálních parametrů. Pro krátká měření ROA spekter a ladění aparatury. Measure Spectrum Měření kalbračního spektra neonové výbojky. Polynomal Ze změřeného spektra neonové výbojky spočte polynom pro Regresson převod pxelové škály na vlnočtovou. Input/Interpolaton /Output Provede převod pxelové škály na vlnočtovou zvolenou metodou nterpolace. Vstupem je *.spe spektrum, výstupem je ASCII_XY *.prn soubor. Processng Append Sčítá vybrané framy z jednoho měření do jednoho výsledného Bnnng souboru. Převod z obrazového módu do spektrálního (sčítají se pxely ve vertkálním směru, pro zvýšení poměru sgnál/šum je možné seskupovat také horzontální pxely). Resze Obecnější procedura než Bnnng. Výstupem může být také záznam v obrazovém módu. Spectral Math Základní operace se soubory v pxelové škále. Požívá se pro snadná sčítání výsledků z různých měření, odečtení sgnálu rozpouštědla apod. Je nutno dbát na to, aby používaná spektra byla zaznamenána přblžně ve stejnou dobu a měla tedy stejnou kalbrac (není-l to splněno, je nutno spektra nejprve zkalbrovat a manpulovat s nm až ve vlnočtové škále). Fourer Transform Fourerova fltrace naměřených spekter. Používá se převážně pro odstranění perodckých artefaktů v oblast nízkých vlnočtů u CID spekter. Clean Feld Umožňuje vymazat falešný sgnál v obrazovém módu. Vhodné pro odstraňování sgnálů z kosmckého záření a jných zdrojů mmo vzorek. 65

66 Součástí vyvnutého programu jsou také základní manpulace se spektry s plnou podporou obrazového módu, která dosud v dostupných komerčních programech nebyla používána Měření ROA spekter Měřící cyklus začíná přložením kladného napětí na EOM. Ramanovo spektrum je akumulováno a uloženo do pole. Poté je na EOM přloženo záporné napětí a akumulovaný sgnál je uložen do pole. Po ukončení jednoho cyklu jsou tato pole dat sečtena a odečtena, čímž dostaneme součet ntenzt I R + I L (CIS, crcular ntensty sum) a jejch rozdíl I R - I L (CID, crcular ntensty dfference), kde I R a I L jsou ntenzty rozptýleného záření odpovídající budícímu pravo- a levotočvě kruhově polarzovanému záření. Spektra CIS a CID jsou ukládána do polí polecis a polecid a následně je zobrazeno spektrum jak Ramanovo (CIS) tak ROA (CID). Měření se opakuje tak dlouho, dokud není dosaženo požadovaného počtu cyklů. Data naměřená v každém cyklu jsou přčítána do odpovídajících polí. Ramanovo a ROA spektrum je na obrazovce po každém cyklu aktualzováno. Tento krok je možno v případě dlouhých akumulací (které probíhají bez přítomnost obsluhy) vypnout a výrazně tak ušetřt čas nutný k záznamu spekter. Pro dosažení dostatečného poměru sgnál/šum (S/N) je potřeba relatvně dlouhá doba akumulace. Proto není vhodné ukládat naměřená data do jednoho souboru, ale rozdělt celkovou dobu akumulace do několka tzv. framů a tyto jednotlvě ukládat do datových souborů. Doba akumulace jednoho framu může být, 5 nebo 3 mnut v závslost na kvaltě vzorku (přítomnost prachových částc, sklon k precptac apod.) a délce jednotlvých expozčních dob (pro krátké expozce je dobré volt kratší nterval pro ukládání framů). Hlavním lmtujícím faktorem je poměrně dlouhá odečítací doba detektoru (řádově kolem s). Pro velce krátké akumulace nutné pro měření neředěných organckých látek (zlomky vteřny) tvoří pak "mrtvá" (nevyužtá) doba podstatnou část celkové doby akumulace. Čím delší akumulační doba, tím je poměr mez využtým a "mrtvým" časem příznvější. Pro většnu vzorků je hlavním lmtujícím faktorem ntenzta vbračních pásů vody a to od deformační vbrace v oblast 65 cm - a dále pak ntenzvní sgnál vbrací klastrů vody v oblast nízkých vlnočtů. Př měření spekter v oblast nad 3 cm -, je možné volt expozce až s. Pro zaznamenávání oblast nžších vlnočtů (která je doposud velm málo prozkoumaná, ncméně je mmořádně zajímavá) jsou nejdelší možné akumulační doby cca 5 až 6 s. V oblast pod 66

67 5 cm - se začíná projevovat útlumová hrana notch fltru, s jstou dávkou opatrnost je však možno měřt až do oblast kolem 7 cm Kalbrace spekter Ramanova a ROA spektra jsou standardně uváděna v relatvních vlnočtech. Kalbrační proces aproxmuje vztah mez pořadovým číslem detekčního elementu (pxelu) a relatvním vlnočtem polynomem třetího nebo čtvrtého stupně. Jako kalbračního standard používáme neonovou výbojku, která v používané spektrální oblast poskytuje dostatečný počet dobře rozlšených úzkých pásů. Významnou částí programu je kalbrační procedura (převod pxelové škály na vlnočtovou). Hlavní částí procedury je knhovna KalbraceCCD.dll vytvořená J. Bokem. Vstupem pro tuto knhovnu je naměřené jednodmenzonální spektrum neonu, typ použté mřížky a volba řádu polynomu, který je používán pro ft (používá se buď polynom třetího nebo čtvrtého stupně). Výstupem jsou pak koefcenty polynomu. Kalbrační procedura následně provede lnearzac vlnočtové škály (po kalbrac nejsou spektrální body vyjádřené ve vlnočtech ekvdstantní; lnearzace znamená jejch přepočet na ekvdstantní body se zvoleným krokem, zpravdla cm - ) zvolenou metodou nterpolace a výps dat ve formátu ASCII_XY. Přesnost použté kalbrační procedury je lepší než cm -. Záznam spektra neonové výbojky: Ze strany obrácené k fokusačnímu objektvu se na notch fltr položí bílá rozptylující papírová maska, která se rovnoměrně osvětlí neonovou výbojkou. Optmální doba akumulace a vzdálenost lampy od bílé masky se nastaví v režmu Focus. Zaznamenávání spekter se provádí výhradně v obrazovém módu, což přnáší několk výhod: Je možno jednoduše zkontrolovat správné zaostření detektoru, polohu detektoru vzhledem k deální zobrazovací rovně (tvar obrazů štěrbny by měl být zhruba parabolcký) a správné naklopení detektoru (podle sklonu spektrálních čar), tak jak je to uvedeno v část o sestavování aparatury. Je-l dobře nastavena expozční doba (aby nedocházelo k nasycení detektoru), zvolí se počet akumulací tak, aby celková doba akumulace byla cca mnuta. Tím je v kalbračním spektru zaručen dostatečně dobrý poměr sgnál/šum. Dále je třeba provést převod do spektrálního módu pomocí tzv. bnnngu. Jelkož př snímání spekter je štěrbna osvětlena rovnoměrně v celé své výšce (na rozdíl od měření Ramanových spekter, kdy je podstatná část celkového sgnálu soustředěna ve střední část detektoru kolem vertkálního pxelu 5), 67

68 používáme př bnnngu pouze střední část obrazu, a to vertkální pxely 3-7, aby v důsledku mírného zakřvení obrazu štěrbny na detektoru nedošlo k přílšnému rozšíření neonových čar a k zavedení nezanedbatelné systematcké chyby kalbrace. Aparatura je př stálé laboratorní teplotě (př expermentech by v laboratoř měla být zapnutá klmatzace) vysoce stablní a zkušenost ukazuje, že zaznamenávání kalbračních spekter jednou za den je více než dostačující Příprava vzorků (obecné zásady) Stručně se zmňme ještě o přípravě a zacházení se vzorky, které je pro měření ROA spekter také velm důležté. První a hlavní zásadou je, že se vzorky je třeba zacházet tak, aby nebyly kontamnovány prachem a dalším nečstotam. Mkroskopcké nečstoty pocházející přímo z obdrženého vzorku je možno s úspěchem odstrant přefltrováním přpraveného roztoku přes mkrofltry Mllpore o velkost pórů, µm (u vzorků s velkou molekulovou váhou je možno použít fltr,44 µm). Složtější je zabránt tomu, aby byl vzorek kontamnován prachovým částcem z okolního prostředí př manpulac a přenášení do kyvety. Především je nutno dbát na to, aby byla kyveta po vyčštění a sušení skladována vždy dnem vzhůru, např. na tenké alumnové fól. Prachové částce je v některých případech možno odstrant pomocí stlačeného vzduchu (pozor na spreje obsahující místo vzduchu stlačenou kapalnu s nízkým bodem varu, která může kyvetu př neopatrné manpulac znečstt). Také je třeba kontrolovat plastové centrfugační mkrozkumavky obsahující mkrofltry (ty mohou před naplněním ve své dolní část obsahovat prachové částce). Všechny používané nádobky (a ppetovací špčky) je také vhodné skladovat odděleně od ostatního vybavení, aby nedošlo jejch kontamnac. Po naplnění je často nutné vyčstt stěny kyvety standardní procedurou (pomocí ethanolu), je však nutno dát pozor na přílšné ochlazování vzorku, ke kterému může odpařováním etanolu docházet. Pro měření v teplotní cele, u vzorků nteragujících se vzduchem apod. je ještě vhodné nappetovat do kyvety na hladnu dostatečné množství nertního slkonového oleje. Pokud se před měřením ukáže, že je v roztoku přítomna prachová částce (podle rozptylu světla), je nutno vzorek vyjmout z kyvety, přefltrovat a znovu naplnt do vyčštěné kyvety. Neprovede-l se to, několkahodnové měření je v lepším případě znehodnoceno (průlet prachové částce ve vzorku vyvolá velkou změnu v rozptýleném záření), v horším případě dojde k tepelnému znčení vzorku (některé vzorky jsou k tomu velm náchylné). 68

69 Některé vzorky vykazují velké fluorescenční pozadí. V prax se osvědčlo ponechat vzorek v laserovém svazku po dobu několka hodn (přes noc), čímž dojde v mnoha případech k dostatečnému potlačení fluorescence. Kyvety s takto znečstěným vzorkem není samozřejmě nutno vkládat do obvyklého vzorkového prostoru, ale je možné je umístt do svazku záření těsně před měrku výkonu (obr. 4.) a zároveň měřt jný vzorek (vyhneme se tak neužtečně ztracenému expermentálnímu času). 4.3 Zpracování spekter Základní procedury př zpracování spekter jsou uvedeny v tab. 4.. V této část se proto zaměříme pouze na metody zlepšování poměru sgnál/šum, a to pomocí spojování pxelů (tzv. bnnng) a Fourerovy fltrace. Jž bylo uvedeno, že zaznamenávání spekter ROA je komplkované díky tomu, že od sebe odečítáme dva soubory přblžně stejně velkých čísel. Z hledska charakterstky šumu je také velm podstatné to, že v ICP strateg jsou obě zdrojová Ramanova spektra zaznamenávána v různých časech a jsou tedy (každé jnak) ovlvněna nežádoucím fluktuacem (průlety prachových částc laserovým svazkem, fluktuace ve vzorku apod.), které se mohou velm výrazně projevt v rozdílovém (CID) spektru. Charakterstka šumu je v tomto případě velm nepříznvá, neboť zaujímá všechny prostorové frekvence a jen v omezené míře je možno j elmnovat pomocí Fourerovy fltrace nebo Savtzky-Golayova vyhlazování. Tato nevýhoda odpadá v SCP strateg, kdy jsou obě zdrojová spektra zaznamenávána současně a vyhlazovací procedury je pak možno s úspěchem použít. Nepříznvý charakter šumu u ROA spekter v ICP strateg je ukázán na obr. 4.. Srovnáme-l například spektrum,5 M roztoku L-Ala-L-Ala s akumulační dobou 8 h se spektrem M roztoku s akumulační dobou hod, vdíme, že ačkolv je velkost sgnálu u prvního spektra zhruba vyšší (což také proporconálně odpovídá vyššímu násobku akumulační doba koncentrace), je vzuální velkost šumu u obou spekter zhruba stejná! Zde také můžeme nalézt důvod poměrně vysokých nároků ROA spektroskope na koncentrac vzorků. Tím pádem je také výhodnější omezovat objem vzorku př zachování co nejvyšší dosažtelné koncentrace než používat větší objem vzorku s nžší koncentrací (to je ovšem velká nevýhoda u peptdových vzorků, u nž je zpravdla obtížné dosáhnout vysokých koncentrací). Naštěstí se ale ukazuje, že aparatura je velm stablní a tudíž je možné provádět velm dlouhé 69

70 akumulace sgnálu. Např. př měření spekter hnge peptdu (vz kaptola 5.4) čnla celková akumulační doba až 9 hodn. (I R - I L ) M (I R - I L ) h (I R - I L ) M Wavenumber (cm - ) (I R - I L ) -5 - h Wavenumber (cm - ) M h (I R - I L ) -6 Wavenumber (cm - ) (I R - I L ) -5 Wavenumber (cm - ) h Wavenumber (cm - ) (I R - I L ) -6 Wavenumber (cm - ) - (a) (b) Wavenumber (cm - ) Obr. 4.: (a) Závslost ROA sgnálu na koncentrac roztoku L-Ala-L-Ala, doba akumulace 8 hodn. (b) Závslost ROA sgnálu M roztoku L-Ala-L-Ala na době akumulace. Závslost vzhledu spektra na počtu seskupovaných horzontálních pxelů je znázorněna na obr. 4.. Ačkolv by se na první pohled mohlo zdát, že se úroveň šumu výrazně snžuje, př podrobnějším pohledu je jasné, že část šumu ve spektrech setrvává a navíc se snžuje efektvní spektrální rozlšení. V původních spektrech je také možno lépe vzuálně rozeznat pásy s nízkou ntenztou. Z těchto důvodů jsme se rozhodl seskupování horzontálních pxelů nepoužívat a 7

71 využívat tak výhod, které pražský spektrometr poskytuje (vyšší spektrální rozlšení než u spekter naměřených v jných laboratořích). CIS (I R + I L ) x bnnng 87 ponts (I R - I L ) -5 CID - -x bnnng (I R + I L ) -9 -x 4 bnnng8 435 ponts 6 Wavenumber (cm - ) (I R - I L ) x bnnng Wavenumber (cm - ) (I R + I L ) -9 3-x 4 bnnng8 9 ponts 6 Wavenumber (cm - ) (I R - I L ) x bnnng Wavenumber (cm - ) (I R + I L ) -9 4-x 4 bnnng8 7 ponts 6 Wavenumber (cm - ) (I R - I L ) x bnnng Wavenumber (cm - ) Wavenumber (cm - ) Wavenumber (cm - ) Obr. 4.: Závslost CIS a CID spekter na počtu horzontálních pxelů seskupených do superpxelu. Jako zdrojové spektrum byla použta,5 hod akumulace M roztoku L-Ala-L-Ala Fourerova transformace a její využtí př zpracování dat Fourerova transformace představuje velm efektvní nástroj pro zpracování expermentálních dat. Fyzkální proces může být popsán např. v časovém oboru pomocí funkce h(t) závslé na 7

72 čase t nebo ve frekvenčním oboru jako obecně komplexní funkce frekvence H(f) kde < f <. (místo času t je možno podobně jako v našem případě brát prostorovou souřadnc x a místo frekvence f prostorovou frekvenc f x ). Funkce h(t) a H(f) lze chápat jako dvě reprezentace téže funkce, mez nmž je možno přecházet pomocí Fourerovy transformace πft H( f) h( t) e dt = (4.6a) πft ht () H( f) e df = (4.6b) Pár funkcí h a H mez nmž je možno přejít pomocí Fourerovy transformace označíme jako ht ( ) H( f). Je-l t měřeno v sekundách, jednotka f je v cyklech za sekundu (nebo je-l t v metrech, pak je f v cyklech na metr). Máme-l dvě funkce h(t) a g(t) a jejch odpovídající Fourerovy obrazy H(f) a G(f), je konvoluce funkcí označovaná jako g * h defnována jako g h= g( τ) h( t τ)dτ (4.7) Dle konvolučního teorému je Fourerovou transformací konvolučního páru jednoduchý součn Fourerových transformací jednotlvých funkcí g h G( f) H( f) (4.8) Ve většně praktckých stuací je funkce h(t) vzorkována (zaznamenávána) v ekvdstantních bodech h = h( n ) n= K,,,,,3, K (4.9) n kde je časový/prostorový nterval (krok, v našem případě pxel) a jeho recproký obraz je označován jako vzorkovací nterval (např. počet vzorků za sekundu, pxelů na metr apod.). Pro každý vzorkovací nterval exstuje specální frekvence nazývaná Nyqustova krtcká frekvence defnovaná jako f c = (4.) Ze vzorkovacího teorému vyplývá, že je-l spojtá funkce vzorkována po ntervalech, je šířka pásma ve frekvenčním oboru omezena na frekvence v absolutní hodnotě menší než f c, tj. je-l H(f) = pro všechny f f, pak je funkce h(t) kompletně popsána dskrétním body h n. c Z teorému také vyplývá, že je-l vzorkována funkce, jejíž šířka pásma není menší než Nyqustova krtcká frekvence, je spektrální hustota obrazu ležící mmo rozsah fc < f < fc nesprávně přesunuta do tohoto oboru. Tento jev se nazývá alasng. 7

73 Předpokládejme, že funkc vzorkujeme pomocí N následných bodů h h( t ), t k, k =,,, K, N (4.) k k k a že N je sudé. V dskrétním Fourerově obrazu se f se bude měnt v rozmezí od f c do f c a bude také obsahovat také N bodů f n n N N =, n=, K, (4.) N V uvedené rovnc je sce N + bodů (a ne N bodů), ncméně oba krajní body jsou stejné (a rovny Nyqustově krtcké frekvenc). Dskrétní Fourerovu transformac je pak možno psát jako a zpětnou Fourerovu transformac jako H n N kn / N = hke π (4.3a) k = h k N πkn / N Hne N n= = (4.3b) Přechod k dvojdmenzonální dskrétní funkc (v našem případě to je obraz na CCD detektoru) je pak už přímočarý N N ( ) ( π ) ( π ) Hn (, n) = hk, k exp kn/ N exp kn/ N (4.4a) k= k= N N hk (, k) = H n, n exp kn / N exp kn/ N ( ) ( π ) ( π ) (4.4b) NN n= n= Provádí-l se Fourerova transformace přímo, zahrnuje N násobení, je to tedy O(N ) proces. Pro velkost pole 34 pxelů by tato operace trvala desítky mnut (,4GHz procesor). Je-l však použt algortmus rychlé Fourerovy transformace (Fast Fourer Transform, FFT), je možno j spočítat jako O(N log N) proces (transformac uvedeného pole je tak možno provést za méně než jednu sekundu). Tento algortmus je také používán v programu používaném na zpracování ROA spekter. FFT přnáší jen jedno malé omezení, tj. počet bodů v každé dmenz musí být roven mocnně čísla. To však praktcky nepřnáší žádné omezení, neboť naměřenou matc je možno vždy rozšířt na požadovanou velkost, doplníme-l chybějící elementy nulam. Pro úplnost přpomeňme ještě uveďme vztah pro konvoluc v dskrétním případě ( ) j M / r s s r (4.5) ( M ) k= / + j k k 73

74 kde s může být např. funkce sgnálu a r funkce odezvy přístroje. Dskrétní konvoluční teorém pak zní takto: je-l sgnál s j perodcký s perodou N, takže je plně popsán pomocí N hodnot s,...,s N-, pak jeho konvoluce s funkcí odezvy r o konečné délce N je Fourerovým párem k prostému součnu SR N / sj krk SnRn (4.6) k= N/+ kde S je dskrétní Fourerova transformace s a R dskrétní Fourerova transformace r. Nyní se konečně dostáváme k cíl použtí Fourerovy transformace pro fltrac expermentálních dat. Fourerovu transformac totž můžeme násobt zvolenou fltrovací funkcí Φ(n,n ) tak, abychom po zpětné Fourerově transformac dostal funkc s potlačeným zvoleným (prostorovým) frekvencem. Jsou-l naměřená data reálná, musí fltrovací funkce splňovat podmínku ( n, n ) ( n, n ) Φ =Φ, která je nejjednodušším způsobem splněna tehdy, pokud je Φ(n,n ) reálná a sudá (symetrcká vzhledem k počátku). Fourerovu fltrac je možno v našem případě používat několkerým způsobem jako pásmovou propust (band pass fltr, lze ho používat na odstraňování šumu z dat) nebo pro potlačení určtých prostorových frekvencí (notch fltr). Zaměřme se nejprve na první velm důležtou oblast, a to na fltrování šumu z naměřených dat. Nejjednodušším fltry na odstraňování šumu jsou pásmové propust, u nchž se využívá toho, že sgnál se nachází pouze v určté část prostorového spektra a cílem je tedy zbylé část potlačt (jde o velm zjednodušený předpoklad, neboť do oblast prostorových frekvencí sgnálu zasahuje také šum, jednoduché fltry jsou zde uvedeny především pro srovnání s dokonalejším fltrovacím metodam). Obr. 4.3: Obecný případ obdélníkového fltru. Pro potlačení vysokých frekvencí samozřejmě platí konstanta a určuje šířku a b výšku propust. n = n =, 74

75 Obdélníkový fltr je defnován jako: Φ(n,n ) = uvntř obdélníku (4.7) Φ(n,n ) = vně obdélníku Obecnější fltr může být popsán rovncí: c d n n když + Φ ( n, n) = a b ( n n ) jnak Φ, = (4.8) kde konstanty c a d udávají tvar fltru. Pokud je c = d =, jde o kosodélník (obr. 4.4), pro c = d = je to elpsa a nakonec pokud c,d <, jde o hvězdcovtý tvar fltru. Fltr přechází na jž uvedený obdélníkový fltr pro c,d. Obr. 4.4: Kosodélníkový fltr popsaný rovncí (4.8) Pro úplnost ještě uveďme rovnc pro fltry měnící se spojtě v zadaném ntervalu: c d n n Φ ( n, n) = max, (4.9) a b Nyní se pokusíme nalézt optmální fltr pro odstraňování šumu. Označme u(t) jako deální sgnál neovlvněný měřícím přístrojem. Měřící proces samozřejmě není deální, naměřenou funkc označíme jako c(t). Naměřený sgnál lze rozdělt na šumovou komponentu n(t) a sgnál s(t) ovlvněný přístrojem, tj. konvoluc deálního sgnálu u(t) s přístrojovou funkcí r(t) ct () = st () + nt () (4.) st () = r u rt ( τ) u( τ)dτ nebo S( f) = R( f) U( f) (4.) kde S, R a U jsou Fourerovy transformace s, r a u. Není-l v naměřených datech přítomen šum, stačí na provedení dekonvoluce přístrojové funkce r vydělt naměřený sgnál C(f) přístrojovou funkcí R(f). Je-l v naměřených datech přítomen šum, snažíme se najít optmální fltr φ(t) nebo 75

76 Φ(f) tak, abychom jeho aplkací na měřený sgnál c(t) nebo c(f) dekonvoluovaný přístrojovou funkcí r(t) nebo R(f) dostal sgnál ut %() nebo U% ( f), který je co nejblžší původnímu deálnímu sgnálu u(t) nebo U(f). Funkc U% ( f) předpokládejme ve tvaru: C( f) ( f) U% Φ ( f) = (4.) R( f) Mnmální rozdíl mez U a U % budeme chápat ve smyslu metody nejmenších čtverců, tj. % ut %() ut () dt= U( f) U( f) df jemnmalzován (4.3) Dosadíme-l do výrazu (4.3) vztahy (4.) a (4.), dostaneme [ S( f) + N( f)] Φ( f) S( f) R( f) R( f) = R( f) S( f) Φ ( f) + N( f) Φ( f) df df (4.4) neboť sgnál S a šum N nejsou korelovány a tedy ntegrál jejch součnu přes všechny frekvence je roven nule. Integrál (4.4) je mnmální pokud je ntegrand mnmalzován vzhledem k Φ(f) pro každé f. Provedeme-l dervac ntegrandu vzhledem k Φ a položíme-l j rovnu nule, dostaneme Φ ( f ) = S( f) S( f) + N( f) (4.5) Díky tomu, že rovnce (4.5) neobsahuje deální sgnál U(f), je možno deální fltr nalézt nezávsle na dekonvoluc funkce S. Nyní potřebujeme určt odděleně S a N, což není bez dodatečného předpokladu nebo nformace možné. Tuto nformac naštěstí obdržíme poměrně snadno, zobrazíme-l hodnotu spektrální hustoty naměřených dat C(f) oprot frekvenc f. Tato hodnota je totž úměrná součtu S + N : S( f) + N( f) C( f) (4.6) Výsledný graf je uveden na obr Téměř vždy v něm lze rozlšt složku pocházející od sgnálu S a šumu N. Naměřeným daty proložíme křvku odpovídající šumu N(f) (tu je nutno extrapolovat v oblast sgnálu), dále proložíme hladkou křvku celkovým sgnálem C(f) a nakonec hledanou funkc sgnálu dostaneme jejch odečtením (v prax je možno zvolt opačnou proceduru, tj. odhadneme funkce N a S co nejlépe tak, abychom dostal celkový sgnál C). Přpomeňme ještě, že výsledný fltr musí splňovat rovnc Φ(f) = Φ(-f). Jak je vdět na obr. 4.5b, je hodnota optmálního fltru blízká jednčce v oblastech. kde je šum zanedbatelný a 76

77 blízká nule tam, kde hraje šum domnantní rol. Použté vztahy jsou samozřejmě platné také v dvojdmenzonálním dskrétním případě (nahradíme-l f n,n ). 6 5 Log scale 4 3 C N extrapolován S odhadnut f (a) Φ(f) f (b) Obr. 4.5: (a) Konstrukce optmálního fltru (b) Optmální fltr dle rovnce (4.5). Log scale 4 Exp. data S N C Log scale n (n = ) n (n = ) Obr. 4.6: Určení parametrů pro optmální ft (4.5), (4.7): ln ( S max ) = 3,, ( const ) ln N =,9, a =, b = 4. Aplkujme nyní tuto metodu fltrování na reálná data uvedená na obr. 4.,5 h akumulace M roztoku L-Ala-L-Ala. Spektrum v obrazovém módu (obr. 4.7e) má rozměry 87 pxelů, rozšíříme ho proto doplněním o nuly na 4 8 pxelů, tak abychom mohl používat rychlou Fourerovu transformac. Fourerův obraz naměřeného spektra v logartmcké škále je znázorněn na obr. 4.7f. Nejprve použjeme obdélníkový fltr (4.7), fltr dle rovnce (4.8) a nakonec optmální fltr pro odstranění šumu (4.5). U optmálního fltru aproxmujeme sgnál S a šum N rovncem v nchž konstanty ln ( S max ), ( const ) ( Sn n ) ( Smax) n n ln (, ) ln a b ( Nn n ) ( N ) const (4.7a) ln (, ) ln (4.7b) ln N a a získáme ftováním řezu dvojdmenzonálního obrazu pro n = a zbývající konstantu b ftem řezu pro n = (obr. 4.6). 77

78 Optmální fltr umožňuje bohužel jen v malé míře elmnovat nepříznvou charakterstku šumu u ICP stratege měření ROA. Na obr. 4.7 je uvedeno srovnání spekter 8 hod akumulace,5 M roztoku a hod akumulace M roztoku L-Ala-L-Ala po aplkac optmálního fltru (naměřená data vz obr. 4.). Přpomeňme, že obě spektra měla vzuálně přblžně stejnou hladnu šumu, zatímco úroveň sgnálu je odlšná. Parametry pro prvně jmenované spektrum byly odečteny jako ln ( S max ) = 5,, ( const ) ln ( S max ) = 4,, ln ( const ), ln N =,8, a = 8, b = 5, pro druhé spektrum N =, a = 5, b = 5 (parametry získány stejnou metodou jako na obr. 4.6). Ze srovnání obou spekter vyplývá, že spektrum (a).5 M roztoku má stále téměř stejnou kvaltu jako M spektrum (b). Fourerovu fltrac můžeme použít ještě jným způsobem: na odfltrování určtých prostorových frekvencí ve Fourerově obrazu (notch fltr). Jak ukážeme na následujícím příkladu, jde pravděpodobně o ještě užtečnější proceduru, než je odstraňování šumu. Nejčastěj se používá obdélníkový fltr uvedený na obr. 4.3, ale s opačnou podmínkou: Φ(n,n ) = uvntř obdélníku (4.9) Φ(n,n ) = vně obdélníku Postup lustrujeme na zpracování spekter roztoku mutantu Arc Repressoru FH (koncentrace 37 mg/ml, spektrální rozlšení 6,5 cm -, výkon na vzorku 66 mw a celková doba akumulace 37,5 hod). Na obr. 4.9 je znázorněno naměřené spektrum v obrazovém módu a jeho Fourerův obraz, na němž jsou dobře vdtelné artefakty mající původ ve velkém sgnálu vbrací klastrů vody (oblast pod 6 cm - ). Obdélníkový fltr byl použt, použté parametry jsou (obr. 4.3): a =, b = 64 a n = 348, n =, a =, b = 64. n = 68, n =, Ze srovnání původního a fltrovaného spektra vyplývá velká výhoda tohoto postupu dochází ke specfckému odfltrování artefaktů způsobených rozpouštědlem zatímco zbytek spektra zůstává v podstatě neovlvněn. 78

79 (I R - I L ) -5 - (a) (e) Naměřená data (87 ): (f) FT (4 8): (I R - I L ) -5 - (b) Wavenumber (cm - ) (g) Obdélníkové okno dle (4.7): n = n =, a = 4, b = 3 (I R - I L ) -5 - (c) Wavenumber (cm - ) (h) Kosodélníkové okno dle (4.8): a = 4, b = 3, c = d = (I R - I L ) -5 - (d) Wavenumber (cm - ) () Optmální fltr dle (4.5), (4.7): ( S max ) =, ( const ) ln 3, ln N =,9, a =, b = 4. Wavenumber (cm - ) Obr. 4.7: Použtí fltrace v oblast prostorových frekvencí na odstraňování šumu ze spekter. 79

80 (I R - I L ) M soluton 8hod (I R - I L ) -5 M soluton hod Wavenumber (cm - ) Wavenumber (cm - ) Obr. 4.8: Srovnání ROA spekter roztoků L-Ala-L-Ala zaznamenaných za rozdílných expermentálních podmínek po aplkac optmálního fltru. (a) (b) (c) (d) Obr. 4.9: (a) Naměřená data v obrazovém módu, (b) Fourerův obraz naměřených dat, (c) Fourerův obraz vynásobený dvěma obdélníkovým fltry, (d) Data po zpětné Fourerově transformac. Špkou je označena oblast, v které se vyskytují perodcké artefakty. 8

81 (I R + I L ) -9 5 (a) (I R - I L ) (b) Wavenumber (cm - ) (I R - I L ) (c) Wavenumber (cm - ) Wavenumber (cm - ) Obr. 4.: Použtí pásmového fltru na odstranění artefaktů ve spektrech. (a) Ramanovo spektrum mutantu FH Arc Repressoru (b) ROA spektrum, (c) ROA spektrum po úpravě pomocí Fourerovy fltrace. Spektra odpovídají datům uvedeným v obrazovém módu na obr Další zpracování (odečet sgnálu rozpouštědla respektve korekc pozadí v CIS a CID spektrech) je výhodné provádět až po kalbrac a převodu do vlnočtové škály s užtím komerčního software pro zpracování spekter (Grams/AI, Thermo Electron Corporaton) Standardzovaný postup zpracování spekter U řady publkovaných spekter není zcela jasné, zda jsou to neupravovaná expermentální data č jakým postupem byla upravena do prezentovaného tvaru. V případě měření ve vodném roztoku v oblast nad 6 cm - v řadě případů není třeba an Ramanova an ROA spektra upravovat, byť by odečet sgnálu rozpouštědla v Ramanových spektrech usnadnl dentfkac málo ntenzvních pásů. Data měřená na našem spektrometru však začínají jž v oblast kolem cm - a obsahují v sobě jak sgnál rozpouštědla (zpravdla vody) tak sgnál pocházející od čelní stěny kyvety, kterého se an př deálním nastavení nelze př prác s malým objemy vzorků v geometr 8

82 zpětného rozptylu zcela zbavt (sgnál stejného původu je snadno rozpoznatelný v Ramanových spektrech měřených na komerčním spektrometru ChralRAMAN a publkovaných Laurencem Barronem, jeho možné projevy v ROA spektrech však nejsou zmňovány). Odečet sgnálu rozpouštědla a následná korekce pozadí (úprava tzv. baselne) je v případě Ramanových spekter procedura zcela standardní a není třeba j blíže komentovat. Úpravy ROA spekter však dosud nejsou an běžné natož standardní a v publkacích se o nch zpravdla taktně mlčí. Proto zde ve stručnost popíšeme postup, který jsme vypracoval, ověřl a nyní pro zpracovaní ROA spekter standardně používáme. 49 V deálním případě by v ROA spektrech neměl být přítomen žádný sgnál an od rozpouštědla an od kyvety. Ve skutečnost však v oblast pod 6 cm - pozorujeme příspěvek falešného sgnálu, který výrazným způsobem deformuje pozadí (v deálním případě nulovou úroveň sgnálu) v ROA spektrech. Nejprve bylo snahou odstrant tento sgnál prokládáním funkce modelující průběh pozadí vybraným body (tedy analogckým způsobem, jakým se korekce pozadí provádí u Ramanových spekter), což se však ukázalo ne zcela konzstentní pro rozdílné vzorky. Proto jsme se rozhodl změřt za standardních expermentálních podmínek ROA spektrum kyvety naplněné rozpouštědlem (na obr. 4. označené jako solvent spectrum ) a toto spektrum jsme potom př korekc pozadí odečetl podobným způsobem, jakým v Ramanových spektrech odečítáme sgnál rozpouštědla. S ohledem na možné zhoršení poměru sgnál/šum v korgovaném spektru v důsledku ne zcela náhodnému charakteru šumu přítomného ve spektrech jsme odečítané spektrum nejprve vyhladl pomocí kubckých splnů (vz obr. 4.B, druhé spektrum od shora). Drtvá většna dosud publkovaných ROA spekter byla měřena na vodných roztocích (na rozdíl od VCD, kde je měření v organckých rozpouštědlech více méně běžné), proto naše měření v TFE představuje určtý průlom. Jak je zřejmé z obr. 4.A, v Ramanově spektru jsou př použté koncentrac domnantní pásy rozpouštědla a pásy od poly(l-prolnu) mají mnmálně o řád nžší ntenztu. I přes tento velm nepříznvý poměr mez ntenztou sgnálu od zkoumané látky a rozpouštědla, bylo měření ROA roztoku poly(l-prolnu) v TFE úspěšné. Výše popsaný postup zpracování ROA spekter se osvědčl v tomto případě. V ROA spektru kyvety s rozpouštědlem však byly navíc v místech některých Ramanových pásů TFE pozorovány drobné artefakty, jež však bylo možno bez větších problémů odečíst, neboť jejch velkost je ve srovnání se sgnálem studovaného vzorku znatelně nžší. ROA sgnál od poly(lprolnu) jsme nezměřl pouze v úzké oblast kolem nejntenzvnějšího pásu TFE ( 83 cm - ), neboť doba akumulace byla zvolena tak, že v této oblast byl detektor nasycen sgnálem. Tyto metodcké výsledky ukazují, že měření ROA spekter v organckých rozpouštědlech je reálné, 8

83 což je mmořádně dobrá zpráva například pro oblast studa vlvu nterakce s rozpouštědlem na strukturu peptdů. st step - solvent subtracton A B fnal spectrum ("solvent" subtracted) I R +I L (x -9 ) raw sample spectrum "solvent" spectrum sample spectrum after solvent subtracton "solvent" spectrum I R +I L (x -9 ) nd step - baselne correcton sample spectrum after solvent subtracton sample spectrum after baselne correcton I R -I L (x -6 ) FT fltered spectrum raw spectrum wavenumber (cm - ) wavenumber (cm - ) Obr. 4.: Ilustrace standardního postupu př zpracování spekter měřených ve vodě. (A) Ramanovo spektrum poly(l-prolnu) v H O. V horní část je proveden odečet sgnálu rozpouštědla, ve spodní část je ukázána korekce pozadí. Výsledné spektrum je znázorněno červeně. (B) Odpovídající ROA spektrum v různých fázích zpracování, zdola nahoru: změřené nezpracované (raw) spektrum, spektrum po Fourerově fltrac, změřené spektrum rozpouštědla překryté vyhlazenou křvkou (červená) a fnální spektrum po korekc vyhlazeným spektrem rozpouštědla. Všechna uvedená ROA spektra mají společnou ntenztní škálu; vodorovné přímky představují nulovou úroveň sgnálu pro každé spektrum. I R +I L (x -9 ) 5 5 st step - solvent subtracton raw sample spectrum "solvent" spectrum sample spectrum after solvent subtracton A B fnal spectrum (after baselne correcton) after "solvent" subtracton I R +I L (x -9 ) 5 5 nd step - baselne correcton sample spectrum after solvent subtracton sample spectrum after baselne correcton I R -I L (x -6 ) "solvent" spectrum raw spectrum wavenumber (cm - ) wavenumber (cm - ) Obr. 4.: Ilustrace standardního postupu př zpracování spekter měřených v TFE. (A) Ramanovo spektrum poly(l-prolnu) v TFE. V horní část je proveden odečet sgnálu rozpouštědla, ve spodní část je ukázána korekce pozadí. Výsledné spektrum je znázorněno červeně. (B) Odpovídající ROA spektrum v různých fázích zpracování, zdola nahoru: změřené nezpracované (raw) spektrum, změřené spektrum rozpouštědla překryté vyhlazenou křvkou (červená), spektrum po korekc spektrem rozpouštědla a výsledné spektrum po provedení korekce pozadí. Všechna uvedená ROA spektra mají společnou ntenztní škálu; vodorovné přímky představují nulovou úroveň sgnálu pro každé spektrum. 83

84 5. Výsledky a dskuze Výsledky prezentované v této kaptole odpovídají bodu 3 cílů práce (změřt ROA spektra vybraných amnokyseln, peptdů a polypeptdů a na základě provedených výpočtů je detalně nterpretovat). Veškerá expermentální data byla změřena na ROA spektrometru popsaném podrobně v kaptole 4, která odpovídá a naplňuje bod cílů práce. Výpočetní postupy vedoucí k prezentovaným smulovaným spektrům využívaly metody a přístupy detalně popsané v kaptole 3, která odpovídá a naplňuje bod cílů práce. Pro lustrac využtí vyvnutých výpočetních postupů byly jako modelové systémy zvoleny dvě amnokyselny, L-alann a L-proln. Tato volba nebyla náhodná. Alann je z pohledu Ramanovy a ROA spektroskope nejvíce studovanou amnokyselnou, na které se dá dobře lustrovat jak orgnalta tak přínos nám zvoleného přístupu k smulac spekter, který do výpočtu zahrnuje dynamcké aspekty struktury molekul v roztoku a který lze as nejlépe vyjádřt termínem konformační středování. Proln byl pro nás zajímavý z řady důvodů. Ten první a nejpřrozenější je, že ROA spektrum prolnu nebylo dosud an publkováno an smulováno. Proln je jako cyklcká molekula zajímavý strukturně a z výpočetního pohledu představuje zajímavý modelový systém. Bylo vcelku přrozené navázat na velm zevrubnou analýzu konformační flexblty prolnu v roztoku a nterpretac jeho Ramanových a ROA spekter studem jného zajímavého systému homopolypeptdu tvořeného pouze prolnovým zbytky. Poly(L-proln) rovněž představuje pro ROA mmořádně zajímavý systém. Je to deální model levotočvého PPII helxu, kterému je v posledních letech věnována značná pozornost. Prolnový zbytek v peptdovém řetězc jako tercární amd nemá N-H skupnu a v Ramanových a ROA spektrech tedy chybí pásy odpovídající amdu III, strukturně velm ctlvému vbračnímu módu. Pomocí ROA nebyl dosud studován, a tudíž pro něj an nebyly nalezeny charakterstcké strukturní markery. Navíc jsme mohl plně využít výsledky studa jeho základní stavební jednotky. Výzkum hnge peptdu představuje logcké završení prováděných studí. Je to peptd, odpovídající dvouvláknovému fragmentu nacházející se v centrální část ldského munoglobulnu IgG, který je stablzovaný dvěma S-S můstky, jež samy o sobě představují strukturní motv pomocí ROA dosud neprozkoumaný. Z pohledu návaznost na nám 84

85 studované systémy je zajímavý bohatým obsahem prolnových zbytků (polovna všech zbytků, 4 v každém vlákně) a dosud ne zcela jednoznačně stanovenou strukturou v roztoku. Jak jž bylo zmíněno v úvodu, tato kaptola má strukturu poněkud odlšnou od předchozích kaptol. Každá podkaptola je věnována řešení jednoho z výše zmíněných problémů a je tvořena stručným textem shrnujícím použté přístupy a dosažené výsledky, za kterým bezprostředně následuje příslušná publkace (rukops, preprnt nebo reprnt). V některých případech jsou pro lepší orentac čtenáře do úvodního textu vkládány také odkazy na obrázky v příslušné publkac. U přložených publkací je zachováno vlastní číslování stránek. 5. Vlv konformační flexblty na tvar pásů v Ramanových a ROA spektrech alannu L-alann je nejjednodušší chrální amnokyselna a představuje tedy velm vhodný modelový systém pro hledání a optmalzac takových výpočetních postupů, které vedou k dosažení deální shody s naměřeným daty. L-alann se v neutrálním prostředí vyskytuje ve formě obojetného ontu, což klade velké nároky především na volbu vhodného modelu rozpouštědla. ROA spektra L-alannu, jeho různých zotopcky zaměněných 9 č protonovaných forem 7, 8 byla jž v mnulost publkována, ncméně pouze v oblast nad 6 cm -. Oblast nízkoenergetckých vbrací, která je, jak se ukazuje, pro nterpretac spekter neméně důležtá, tak zůstala opomnuta. Spektra alannu také byla jž dříve smulována pomocí ab nto metod, ale dynamka postranních skupn byla doposud považována pouze za vedlejší produkt tvorby 3, 3 klastrů s molekulam vody. Obr. 5.: Obojetný on L-alannu s naznačeným možným rotacem postranních skupn. 85

86 Detalní analýza Ramanových a ROA spekter obojetného ontu L-alannu prokázala, že tvar spektrálních pásů je do značné míry ovlvněn rotací skupn NH + 3, CO a CH 3 (obr. 5.). Spektra L-alannu ve vodném roztoku byla měřena jž od cm - a porovnána s komplexním smulačním ab nto (B3LYP/COSMO/6-3++G**) výpočty molekulárních energí a spektrálních parametrů. Spektrální pásy ve změřených spektrech projevují různou ctlvost k rotačnímu pohybu skupn (vz obr. 5 na straně přílohy ); pásy ctlvé k rotac jsou v Ramanových spektrech zřetelně šrší a naopak v ROA spektrech málo ntenzívní. Jestlže př výpočtech vezmeme tyto dynamcké aspekty v úvahu a provedeme Boltzmannovo středování příspěvků od jednotlvých konformérů, dosáhneme nejen lepšího souhlasu smulovaných spekter s expermentem (vz obr. 6 na straně přílohy ), ale můžeme odhadnout tvar a výšku rotačních barér (vz obr. na straně 7 přílohy ). Vlv molekulární flexblty lze také velm dobře potvrdt na základě porovnání šířky pásů v Ramanových spektrech L-alannu ve vodném roztoku, v práškovém (polykrystalckém) vzorku a v amorfní struktuře vznklé odpařením vody z kapky roztoku deponované na hydrofobním substrátu (tzv. Drop Coatng Deposton Raman 5-5 DCDR metoda) sestávajícím z vyleštěné ocelové destčky pokryté tenkou vrstvou teflonu (destčky SpectRIM TM od Tenta Scences), vz obr. 7 na straně přílohy. Obr. 5.: Příklad rgdní (Gly-Pro) a flexblní (Pro-Gly) molekuly s naznačeným hlavním stupn volnost. Rgdta Gly-Pro je dána tím, že pokud je proln na C-konc dpeptdu, rotace kolem vazby C α -N (torzní úhel Φ) bude pětčlenným kruhem výrazně omezena. Pro-Gly je ve srovnání s Gly-Pro flexblnější, neboť proln se v tomto případě nachází na N-konc dpeptdu a rotace kolem torzního úhlu Φ je v tomto případě volná. Tato práce se také snaží poukázat na fakt, že u ROA spekter může v důsledku molekulární flexblty dojít dokonce k vyrušení některých pásů, neboť rotace kolem jednoduché vazby v řadě případů nejen posouvá polohu maxma pásu v Ramanově spektru, ale vede ke změně znaménka odpovídajícího pásu v ROA spektru. Právě to je příčnou zvýšené ctlvost ROA k dynamckým aspektům struktury molekul. To lze velm názorně lustrovat na spektrech dpeptdů skládajících se z prolnu a glycnu nebo prolnu a alannu. Pro flexblních systémy (například Pro-Gly) pozorujeme nejen šrší pásy v Ramanových v ROA spektrech, 86

87 ale v ROA spektrech krom toho zpravdla pozorujeme méně pásů a celé spektrum se jeví jakoby zjednodušené, neboť některé pásy v důsledku konformačního středování praktcky vymzely. Rozšíření spektrálních čar a složtost č naopak výrazná jednoduchost ROA spekter tedy může sloužt jako velm dobrý ndkátor rgdty respektve flexblty daného systému (vz obr. 8 na straně 3 přílohy ). 87

88 5. Studum dynamky prolnového kruhu a nterakce s rozpouštědlem Proln představuje důležtý stavební kámen většny peptdů a protenů, který zásadním způsobem ovlvňuje jejch strukturu a bologckou funkc, 53 zvyšuje například sklon k tvorbě ohybů u β-skládaného lstu, 54 dále je také známo, že toxcta některých peptdů je závslá na jeho konformac. 55 Proln je jednou amnokyselnou vyskytující se v bologckých systémech, která obsahuje sekundární amd. Je to také velm zajímavý modelový systém, který lze studovat náročným teoretckým technkam. Molekulu prolnu je možné popsat pomocí tří hlavních stupňů volnost: rotace skupny COO - a dvou pseudorotačních parametrů popsujících konformac prolnového kruhu ampltudy a fáze. 56 Obr. 5.3: Dvě konformace L-prolnu s nejnžší energí, energe obou konformerů je téměř stejná (vz tab. na straně přílohy ) Ramanova a ROA spektra roztoků L- a D-prolnu ve formě obojetného ontu v H O D O byla změřena v oblast 8 cm - a byla analyzována s ohledem na konformační vlastnost pětčlenného prolnového kruhu. Byl zkoumán vlv omezené konformační flexblty prolnu a nterakce s rozpouštědlem na nehomogenní rozšíření spektrálních pásů. Interpretace spekter je založena na ab nto výpočtech zahrnující mplctní (kontnuální) explctní modely rozpouštědla. Aby bylo možné modelovat vlv konformační středování na spektra, byla vypočtena dvojdmenzonální plocha potencální energe popsující zkrabacení pětčlenného kruhu (vz obr. na straně 5 přílohy ) a na jejím základě bylo možné vysvětlt pozorované selektvní rozšíření spektrálních pásů. Spektra v roztoku odpovídají přblžně rovnoměrnému zastoupení dvou energetcky blízkých rovnovážných konformací prolnového kruhu A a B (vz obr. 5 na straně 8 přílohy ), zatímco spektra práškového vzorku (v tomto případě pouze Ramanova spektra) svým úzkým spektrálním pásy a jejch poloham potvrzují ve shodě s výpočty domnantní přítomnost konformace A. 88

89 Tyto výsledky potvrzují, že expermentální data nemohou být do všech podrobností vysvětlena a nterpretována, pokud do výpočtu nezahrneme konformační rovnováhu, molekulární flexbltu a vlv rozpouštědla. Jejch důležtost je pro různé pásy různá; některé nejsou ke změnám geometre molekuly č prostředí přílš ctlvé, některé jsou ctlvější k molekulárním pohybům a jné naopak k nterakc s normálním vbračním módy rozpouštědla. I nadále však exstují určté odchylky mez expermentálním a smulovaným daty, například v ntenztách některých pásů a v ojednělých případech ve znaménku ROA. Proto zatím není možné odhadnout relatvní zastoupení obou konformerů v roztoku s vyšší přesností než je uváděný přblžný poměr :. Pro alann a proln byl také zkoumán vlv použtého DFT funkconálu na přesnost výpočtu harmonckých frekvencí. Intenzta Ramanových a ROA pásů nebyla do statstckého zpracování promítnuta, byla však využívána př detalním přřazení pásů. Př statstckém zpracování byl hledán parametr a v lneární závslost C = ae (5.) kde C a E jsou vypočtené respektve expermentální frekvence vbračních pásů ve spektrální oblast 7 cm -. Parametr a byl hledán metodou nejmenších čtverců, tj. ( C ) ae = mn (5.) Položíme-l dervac uvedeného členu rovnu nule, dostaneme pro hledaný koefcent a vztah: a = V deálním případě by mělo platt, že a =. V takovém případě hledáme střední kvadratckou odchylku vypočtených hodnot ve vztahu která ční ( C E) = C CE E (5.3) = E, (5.4) n = ( C E ) Střední kvadratcká odchylka pro vztah (5.) se pak vypočte podobně jako: n. (5.5) = δ ( ) C ae = n ( C ae ) n (5.5) 89

90 Hodnoty uvedených statstckých parametrů pro výpočet vbračních frekvencí jsou uvedeny v tabulce 5. (pro L-alann) a v tabulce 5. (pro L-proln). Nejlepší výsledky (ve smyslu nejnžší dosažené odchylky) jsou v tabulkách označeny hvězdčkou (*), funkconály dávající nejlepší výsledky jsou zvýrazněny barevně. Ve všech případech jde o hybrdní funkconály B3P86, B3PW9 a B3LYP (vz též tab. 3.5). Tab. 5.: Statstcké srovnání přesnost výpočtu vbračních frekvencí L-alannu v oblast 7 cm - pro různé DFT funkconály (a také pro HF a MP výpočty ). Standardní odchylky jsou uvedeny v cm -. funkconál/metoda a (C E) δ(c ae) HF BhandHLYP MP MPW9PW * BLYP PBEPBE.38 5* 5* B3P * 6* 6* B3PW9.9985* 7 7 B B3LYP.9968 HCTH HCTH VSXC LSDA OLYP SVWN BPW PW9PW G96LYP PB BLYP PW9LYP PBELYP

91 Tab. 5.: Statstcké srovnání přesnost výpočtu vbračních frekvencí L-prolnu v oblast 7 cm - pro různé DFT funkconály (a také pro HF a MP výpočty). Standardní odchylky jsou uvedeny v cm -. proln v H O proln v D O funkconál/metoda a (C E) δ(c ae) funkconál/metoda a (C E) δ(c ae) HF.98 9 HF BHandHLYP * BHandHLYP MP MP.78 7 MPWPW * MPWPW BLYP PBEPBE.39 B3P * 4* BLYP.37 9 B3PW9.48 5* 4* B3P86.* 7* 7* PBEPBE.3* 9 9 B3PW9.* 7* 7* B98.5* 6 6 B * 9 9 B3LYP.* 5* 5 B3LYP.9973* 9 9 HCTH HCTH HCTH HCTH VSXC OLYP OLYP VSXC LSDA LSDA BPW SVWN SVWN BPW PW9PW PW9PW G96LYP G96LYP BLYP BP BP BLYP PW9LYP PW9LYP PBELYP PBELYP

92 5.3 Studum konformace prolnového kruhu v poly(l-prolnu) Konformace polyproln II (PPII) označuje levotočvou šroubovc s třem amnokyselnovým zbytky na závt (3 -helx), která není stablzována ntramolekulárním vodíkovým vazbam a která původně byla považována pouze za jednu z možných konformací poly(l-prolnu) v roztoku. Ukazuje se však, že tuto konformac mohou zaujímat peptdové sekvence neobsahující proln. 57, 58 Konformace PPII je v poslední době v centru pozornost neboť hraje důležtou rol v neuspořádaných polypeptdech a v tzv. msfoldngu protenů. 59 Ačkol peptdové sekvence neprolnových zbytků v konformac PPII jž byly pomocí ROA studovány, spektra samotného poly(l-prolnu) doposud nebyla publkována. Naše práce se snaží tuto mezeru vyplnt. Navíc se ukazuje, že ROA spektra přnášejí také velm cennou nformac o konformac postranních řetězců, jejchž vlv na charakter ROA spekter protenů dosud nebyl (snad s výjmkou kromě tryptofanu 57 ) studován. Obr. 5.4: Schematcké znázornění přenosu tenzorů z prolnového trpeptdu na dekapeptd. Ramanova a ROA spektra poly(l-prolnu) byla změřena v šrokém spektrálním rozsahu a analyzována s ohledem na konformac postranního prolnového řetězce. Analýza byla založena na srovnání spekter s ab nto smulacem poloh a ntenzt spektrálních pásů. Byl prokázán výskyt obou konformerů pětčlenného kruhu (vz obr. na straně 4 přílohy 3) s přblžně stejným zastoupením. Smulace byly prováděny na -meru (L-Pro). Přenosem tenzorů molekulárních vlastností (kaptola 3.8) z trprolnových fragmentů způsobem naznačeným na obr. 5.4 byla 9

93 zkonstruována spektra různě dlouhých olgomerů v konformac PPII jako modelů dlouhého řetězce poly(l-prolnu). Na základě získaných výsledků bylo možno usoudt, že obě hlavní konformace prolnového kruhu (obr. 5.3) jsou v polypeptdovém řetězc zastoupeny přblžně stejně (vz obr. 4 na straně přílohy 3). Změřená spektra navíc potvrzují, že polypeptd zaujímá PPII helkální strukturu ve vodě v TFE (vz obr. 3 na straně 9 přílohy 3). Struktura v roztoku není rgdní, ale je porušována fluktuacem, které ovlvňují spřažení vbračních módů prolnových kruhů a způsobují rozšíření ROA pásů. Navíc se ukazuje, že příspěvek postranních řetězců a hlavního řetězce k ntenztě ROA pásů je přblžně stejný, proto je porozumění původu obou těchto zdrojů sgnálu pro určování struktury peptdů pomocí ROA velm důležté. Peptdová vazba v poly(l-prolnu) vytváří tercální amd, takže v Ramanových a ROA spektrech se nevyskytují pásy odpovídající vbrac amd III, které v případě jných polypeptdů a protenů slouží jako velm ctlvý ndkátor sekundární struktury (v případě PPII struktury je takovým ndkátorem poztvní ROA pás 3 cm - ). 5 Poloha a ntenzty pásů poly(l-prolnu) jsou pro obě použtá rozpouštědla s výjmkou pásu amdu I nápadně shodná (vz obr. 3 na straně 9 přílohy 3). Pás amdu I (převážně C=O valenční vbrace, 648 cm - v TFE, 633 cm - v H O) je nejvíce ovlvněn formováním vodíkových vazeb a polartou rozpouštědla. Tvar (a znaménko pásů) ROA spektra poly(lprolnu) v oblast 9- cm - (+-++-) a 64-7 cm - (++-) se zdá být charakterstcký pro PPII konformac a může sloužt jako spolehlvý ndkátor přítomnost této konformace v peptdech bohatých na proln (vz též kaptola 5.4). 93

94 5.4. Ramanova optcká aktvta hnge peptdu a jeho analogů Hnge peptd představuje dvouvláknový fragment nacházející se v centrální část ldského munoglobulnu IgG 6, jež na jedné straně spojuje dva páry těžkých řetězců (Fab, Fc) a na druhé straně představuje místo, kolem kterého se tyto řetězce mohou otáčet ("hnge" = závěs, pant, obr. 5.6). Obr. 5.6: Model molekuly ldského munoglobulnu IgG s vyznačenou částí odpovídající hnge peptdu. 6 Hnge peptd je paralelní dmer oktapeptdu H-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-OH spojený dvěma dsulfdovým můstky. Jedná o poměrně pevnou strukturu jednak díky oběma dsulfdovým můstkům a také díky tomu, že je to sekvence velm bohatá na proln. Hnge peptd je zajímavý tím, že může sloužt jako nosč aktvních sekvencí (sám o sobě je munologcky neutrální a obsahuje šest nezávslých koncových skupn: -NH a -OH na threonnovém postranním řetězc a na C-termnálním karboxylu). Z hledska ROA spektroskope a jejího využtí pro studum struktury a dynamky peptdů a protenů v roztoku představuje hnge peptd velm zajímavý systém, neboť je to poměrně rgdní peptd střední 94